Robos在神經精神疾病中的研究進展

黃唯 綜述 徐忠祥 審校

遵義醫科大學附屬醫院神經內科，貴州 遵義 563000

Robo是由SEEGER等[1]最先于1993年從黑腹果蠅中克隆得到，是一種與發育相關的跨膜蛋白，與其配體Slit結合在神經系統發育中起重要作用。Robo家族有4名成員，Robo1蛋白為神經細胞黏附分子家族成員之一，其結構包括由5個免疫球蛋白(immunoglobulin，Ιg)樣序列和3個Ⅲ型纖維連接蛋白(fibronectin typeⅢ，FNⅢ)結構域組成的胞外區、跨膜區和4個保守的Robo特異性序列CC0-CC3組成的胞內區[2]。Robo2、Robo3與Robo1相比，有相似的胞外區，但胞內區缺乏CC2、CC3序列[3]。Robo4胞外域的排列方式與所有其他Robo家族成員的排列方式明顯不同，其胞外區只有2～3個Ιg樣序列 和2個FNΙΙΙ，胞內區缺少CC1和CC3[4]。研究發現Robos蛋白參與神經軸突和樹突定向生長、神經細胞遷移及外周神經修復等生理病理過程[5-7]。在多種神經精神疾病的發病機制中起重要作用。故本文就Robos在相關神經精神疾病中的研究現狀進行綜述，以期為其發病機制及治療提供新的理論依據。

1 Robo1調控神經軸突導向及細胞遷移

Robo1在神經軸突導向方面具有非常重要的作用，主要是維持腹部軸突導向以阻止其穿越中線[8]。其機制可能是Robo1與Slit2結合引起肌動蛋白細胞骨架重組調節肌動蛋白絲聚合和細胞遷移[9-10]。另外GTPase活化蛋白(GAPs)、Cdc42也參與Robo1/Slit介導的中線排斥，Robo1與Slit2結合在體內減弱ADP-核糖基化因子4A(Arl4A)-Robo1的相互作用，從而減弱Cdc42介導的細胞遷移[11-12]。

1.1 神經膠質母細胞瘤 神經膠質母細胞瘤是一種預后較差的原發性腦腫瘤[13]。以往有很多研究表明Robo/Slit信號通路在腫瘤細胞的增殖、遷移、血管生成等過程中起重要作用[14]。有研究發現Robo1在不同級別膠質母細胞瘤中mRNA和蛋白質水平上均呈高表達，并且Robo1/Slit2信號傳導通過Cdc42-GTPase失活抑制瘤細胞遷移和侵襲[10]，其可能成為神經膠質母細胞瘤防治的潛在靶標[15]。NGUEMGO KOUAM等[10]研究發現，膠質母細胞瘤細胞系U-373 MG和U-87 MG的遷移能力與Robo1和Slit2存在相關性，Robo1或Slit2高表達可降低遷移相關蛋白的表達，從而抑制瘤細胞的遷移。最近一項研究表明，Robo1-CAR-NK92細胞對神經膠質母細胞瘤和膠質瘤細胞具有很強的靶向殺傷作用[16]。另外小分子RNA也參與了Robo1在膠質母細胞瘤中的作用，microRNA-218降低Robo1表達抑制膠質母細胞瘤的遷移和侵襲[17]，miR-219-5p負性調控Robo1表達抑制瘤細胞增殖和侵襲并誘導其凋亡[18]，值得注意的是，在越高級別腫瘤組織中Robo1的表達越高，而microRNA-218與之相反，提示臨床治療中調控Robo1表達水平至關重要[19]，并且現已有研究將Robo1列為神經膠質母細胞瘤基因治療的一個靶標[20]。在此基礎上深入研究Robo1在膠質母細胞瘤中的作用機制,可為今后膠質母細胞瘤的診斷、靶向治療及預后提供全新的診療思路。

1.2 閱讀障礙 閱讀障礙是一種常見的學習障礙，其病因涉及神經生物學和遺傳學[21]。HANNULA-JOUPPΙ等[21]研究發現Robo1是閱讀障礙的易感基因之一，Robo1可通過調節胼胝體的纖維軸突生長和纖維結構發育等微結構來影響人的閱讀能力[22]。由于Robo1基因編碼產物可導向樹突及軸突的生長[2]，故有研究人員推測Robo1基因編碼異常能對神經軸突造成影響，導致中樞神經發育異常而致病[23]。另有研究表明轉錄因子Lhx2是Robo1的負調控因子，Lhx2通過調節Robo1的表達參與丘腦發育，其缺失影響丘腦內側膝狀體纖維投射，從而導致聽覺皮層區域的受損影響閱讀[24]。此外發現閱讀障礙易感性單倍體內的三種新型變異體，可能是Robo1基因的低表達致病的原因[24]。

1.3 脊髓損傷 脊髓損傷后功能恢復的關鍵是促進軸突分支生長，研究發現Robo1/Slit2信號是參與增強軸突再生及重建神經元回路的關鍵通道，Robo1、Slit2、RhoA可定位于脊髓的同一神經元中，Slit2通過抑制Robo1下調RhoA表達，從而刺激軸突分支生長來改善脊髓的功能恢復[25]。另外，通過脊髓內注射RNAi慢病毒敲除Robo1也可以改善受損脊髓的功能[25]。因此，在涉及脊髓損傷中是否可通過調節Robo1的表達來恢復脊髓功能，提高患者的生活質量具有潛在的研究價值。

2 Robo2介導神經軸突導向及調控多巴胺能系統功能

Robo2是指導背部軸突導向的主要受體[8]，其既可促進Slit在神經中線的排斥作用，也可抑制Robo1/Slit信號的排斥作用而促進軸突穿越中線[24]。另外，Robo2/Slit2信號通路控制著下行多巴胺能縱向軸突的側向定位和正確導向[26]。

2.1 周圍神經損傷 研究發現，切斷背根神經節的軸突可以改變Robo/Slit基因的表達，Robo/Slit主要受提供營養支持的靶組織的影響，外周神經損傷后Robo2/Slit1可誘導受損初級感覺神經元的再生，并可促進斷裂背根神經節神經元的生長[7]。另外，小鼠坐骨神經損傷后在脊髓運動神經元和背根神經節的感覺神經元中檢測到Robo1-2 mRNA、Slit1-3 mRNA的表達，并且在損傷的第4～14天Robo1和Robo2在坐骨神經殘端軸突再生中表達，而Slit3是再生過程中神經橋和遠端神經殘端表達的主要配體，提示Robo/Slit3信號通路在周圍神經修復中起關鍵作用[27]。

2.2 精神分裂癥 中腦多巴胺系統由中腦腹側被蓋區和黑質致密部組成，對運動功能、動機、獎賞、學習和記憶至關重要，并且中腦腹側背蓋區與認知和心理活動的精神行為存在一定關聯[28]。研究發現，Robo1和Robo2在多巴胺能神經元的形成中起重要作用，且可能不依賴與slit結合[29]。Robo2在中腦腹側被蓋區高表達，且對于維持腹側被蓋區中的抑制性突觸至關重要，在小鼠實驗中，Robo2失活后自發性抑制性突觸后電位頻率降低[30]。GORE等[30]證實在腹側被蓋區，Robo2失活會增強多巴胺作用，導致大腦興奮性和抑制性神經遞質系統失去平衡，這可能是精神分裂癥的發病機理。并且已有研究鑒定出Robo2是精神分裂癥的易感基因之一[31]。

3 Robo3基因突變及其對神經軸突的影響

Robo3可競爭性抑制Robo1與Slit的結合，消除Robo1對神經中線的排斥作用，促進軸突穿越中線[32]。Robo3在中腦、小腦和脊髓回路中廣泛表達[33]。

3.1 水平注視麻痹伴進行性脊柱側彎(horizontal gaze palsy and progressive scoliosis，HGPPS) HGPPS是一種罕見的先天性疾病，為常染色體隱性遺傳，其特征是在兒童期或青春期出現眼球水平運動受限和進行性脊柱側彎[34]。值得注意的是，HGPPS患者具有腦干發育異常和腦干神經元通路交叉的缺陷[35]。遺傳研究證實，HGPPS的發病機制與Robo3基因突變有關，Robo3通過阻斷軸突對排斥性Slit受體的反應來允許神經中線交叉，這種作用機制決定了腦干神經軸突交叉以及由此產生的腦干形態變化[32]。目前為止，Robo3引起HGPPS的突變存在40余種，主要致病基因位于11q23-25號染色體上，該基因包含28個外顯子，編碼1386個氨基酸的跨膜受體蛋白，對軸突的引導和調控具有重要意義[36]。因Robo3基因突變導致腦干的神經通路交叉出現異常，故推測患者的水平注視麻痹可能與腦橋網狀結構以及內側縱束中發育的軸突不能穿過中線從而導致信號無法向外展神經傳達有關[37]。關于脊柱側彎方面的機制，目前認為Robo3突變通過改變配體識別或蛋白質折疊來影響蛋白質功能變化，對神經纖維束的形成發展或對脊柱側彎產生影響[38]。另外也有學者認為Robo3基因突變可能誘發病理性骨骼肌肉改變，從而促進脊柱側彎[39]。此外神經源性機制學說認為腦橋網狀結構中的下行脊髓纖維束與皮質脊髓束一起，介導從大腦到脊髓的控制信號，以驅動運動和調節肌肉張力[32]。綜上所述，Robo3基因在腦干神經軸突中起重要作用，其突變會導致功能喪失，是HGPPS發生的關鍵因素。

3.2 自閉癥(Autism) 自閉癥是一種由神經精神發育障礙導致的疾病，主要表現為在兒童期就出現的社交障礙及一些機械的重復行為。自閉癥的主要治療靶點是5-羥色胺轉運蛋白(SERT)，已證實果蠅中SERT的表達受到Robo2和Robo3的正調控[40]。通過對252個家庭的基因組分析，得到Robo3的四個內含子單核苷酸變異體(SNP)和Robo4的三個SNP與自閉癥有關聯[41]。Robo基因的異?？赡芡ㄟ^干擾血清素能系統的功能或通過軸突導向受損影響神經發育[41]。自閉癥發病機制中不僅只有Robo3介導，Robo1也參與其中。研究發現，自閉癥患者大腦發育的特征是樹突棘生長增加，其中硫酸肝素(HS)的缺乏對Robo1和Slit的結合過程有重要影響，Robo1與Slit之間的相互作用減少會降低Robo1中CC3與srGAP1的SH3的結合，最終導致肌動蛋白聚合增加，樹突棘形成增加[41-42]。

3.3 癲癇 癲癇是由多種病因導致的腦部神經元高度同步化異常放電引起的臨床綜合征[43]。在顳葉癲癇大鼠模型中的研究發現，Robo3在癲癇模型慢性期表達降低，其Robo/Slit信號通路下游活化的srGAP會造成Rho GTPases失活，引起軸突的異常生長，從而使正常的神經網絡遭到破壞[44]。另外，有研究認為Robo3可能參與了皮質發育過程中中間神經元的遷移和形態分化，而這些中間神經元的缺失會導致大腦興奮和抑制失衡[45]。綜上所述，Robo3可能通過調節神經軸突異常生長及神經元的興奮和抑制失衡參與癲癇的發生。

4 Robo4在血管內皮細胞中作用

Robo4主要與調節內皮細胞功能和血管通透性有關，Robo4/Slit2信號通路對內皮細胞通透性的調控起重要作用[46]。Robo4在發育中的大腦廣泛表達，可通過抑制Slit的排斥作用來調節新生大腦皮層中神經元的放射狀遷移[47]。

研究認為腦損傷中血腦屏障的破壞加重腦水腫和神經功能障礙[48]。有研究證實Robo4與調節內皮細胞功能和血管通透性有關[49]，且Robo4/Slit2信號通路對內皮細胞通透性的調控起重要作用[46]。并可通過阻斷血管內皮生長因子抑制血管生成[50]，Robo4在反應性星形膠質細胞中表達，可與Slit2結合后通過旁分泌或自分泌的形式參與星形膠質細胞的形態變化[51]，同時可通過抑制Robo1/Slit2通路減弱血管內皮生長因子作用，維持正常的血管通透性及內皮細胞遷移[52]。有研究顯示缺血性腦卒中損傷早期Robo4和Slit2的表達即明顯升高，且表達水平均為梗死側大于非梗死側，提示Robo4/Slit2可能參與卒中早期損傷后的保護機制[53]。Robo4的內皮穩定作用是通過下游的Paxillin24介導的，Slit2可能通過Robo4-Paxillin介導的Rac1激活部分穩定了內皮連接蛋白，從而降低了血腦屏障的通透性[48]。另外，腦損傷后通過Robo4-Paxillin依賴性的Rac1活化穩定緊密連接蛋白[54]，Robo4和Paxillin參與了Slit2激活Rac1的過程[55]。此外，Robo4/Slit2可通過抑制Src激酶磷酸化來干擾血管生成[56]。近年有研究發現膜聯蛋白A2是Robo4配體，可調節Robo4-paxillin-ARF6信號傳導，在維持血腦屏障功能方面起重要作用[57]。除了Robo4在缺血性腦損傷中的作用外，其它Robo亞型也參與了腦缺血損傷過程。有研究發現腦缺血損傷后神經保護作用可能是通過Robo1及Slit2表達增加來介導的，并且Robo1/Slit2信號通路可調節下游分子Rho GTPase以穩定細胞骨架，從而維持缺血腦細胞的功能、預防或減少突觸和樹突的破壞[58]。在小鼠缺血性腦卒中模型研究中，神經元中Slit1缺失或反應性星形膠質細胞中Robo2降低抑制神經母細胞向病變部位遷移，神經母細胞通過Robo2/Slit1信號傳導及反應性星形膠質細胞增生遷移至病變部位，而由Robo2/Slit1信號介導的反應性星形膠質細胞增生中肌動蛋白細胞骨架的重排是其有效遷移的關鍵[55]。綜上所述，Robo/Slit信號在缺血性腦血管疾病中的研究已成為熱點，尤其是Robo4在血管內皮細胞的功能調節，有望成為缺血性腦血管疾病治療的重要靶點。

5 展望

綜上所述，Robos在神經精神疾病中的作用主要與其在軸突導向上的正確定位及引導有關，也與其和各種小分子受體結合后發揮作用緊密相關。目前研究的比較集中的是Robo1和Robo3，Robo1與神經膠質母細胞瘤的研究是個熱點，可以從基因層面上為其治療提供新的思路。Robo3基因突變的類型及新的突變是HGPPS的重點研究方向，其是否參與癲癇發生和發展仍需要進一步研究。Robo2在精神疾病方面未來或許有較大發展潛力。Robo4/Slit信號通路在新生血管方面的研究比較充足，可為缺血性腦血管病提供一些理論基礎，未來也可為其治療提供新思路。雖然目前對于Robos在部分神經精神疾病方面的研究已取得一定進展，但對于如何應用到臨床診斷或治療上還尚未實現，相信未來隨著研究的不斷深入，對Robos的研究會為神經精神疾病的臨床診斷和治療提供更充足的理論依據。