電化學(xué)法檢測(cè)芴的細(xì)胞毒性

周實(shí)，李錦蓮，李秀玲，郭曉玲，張樹萌，武冬梅

佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，佳木斯 154007

芴被世界衛(wèi)生組織和美國(guó)環(huán)境保護(hù)局列為多環(huán)芳烴(PAHs)類化合物大氣暴露的評(píng)價(jià)指標(biāo)，它是一種可被人體吸入的神經(jīng)毒性物質(zhì)[1]，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，僅由2個(gè)苯環(huán)及一個(gè)五元環(huán)組成，因其揮發(fā)性高，具有毒性，且空氣中含量高，被美國(guó)環(huán)境保護(hù)局列為16種優(yōu)先控制的PAHs之一[2]。芴主要來源于汽車尾氣排放、秸稈燃燒、工業(yè)生產(chǎn)，是制備塑料、農(nóng)藥、樹脂、染料和藥品的重要工業(yè)原料[3]。近年由于環(huán)境污染，芴逐漸進(jìn)入人類日常生活領(lǐng)域，甚至在人類的食品中也出現(xiàn)了芴的蹤影，是食品中PAHs類污染物的主要來源。Essumang等[4]對(duì)煙熏魚樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)芴的檢出率高達(dá)18%～52%；馬運(yùn)明等[5]在污水處理廠的入水和回用水中均檢測(cè)出較高含量的芴。

研究表明，PAHs類化合物具有“三致效應(yīng)”，長(zhǎng)期接觸PAHs會(huì)對(duì)人體造成不可逆的損害。近年來，體外試驗(yàn)[6]成為PAHs對(duì)環(huán)境和人類潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的快速方法，常用的方法有染料排斥法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、四唑鹽比色法(MTT)和三磷酸腺苷(ATP)發(fā)光試驗(yàn)，然而這些方法難免需要使用有毒的染色劑、前處理復(fù)雜、檢測(cè)范圍有限，新興的細(xì)胞電化學(xué)技術(shù)憑借其簡(jiǎn)單、快速、靈敏和可即時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)成為了細(xì)胞活性評(píng)價(jià)的一個(gè)可靠方法。2015年，Zhu等[7]利用細(xì)胞電化學(xué)法評(píng)價(jià)重金屬類和氯酚類污染物的毒性，發(fā)現(xiàn)通過細(xì)胞中嘌呤核苷酸代謝過程中嘌呤含量的變化，可以更早檢測(cè)到外源物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的影響，而傳統(tǒng)的MTT法是通過終點(diǎn)變化評(píng)價(jià)細(xì)胞活性的體外試驗(yàn)，只有在細(xì)胞發(fā)生死亡時(shí)才能檢測(cè)到變化，細(xì)胞電化學(xué)法的靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的MTT法。

筆者所在團(tuán)隊(duì)前期研究了V79和BALB/c 3T3這2種細(xì)胞的電化學(xué)行為及信號(hào)來源，其中黃/鳥嘌呤(G/X)的信號(hào)相比尿酸(UA)更明顯[8]。因此，本文以黃/鳥嘌呤的電化學(xué)信號(hào)為定量依據(jù)，利用基于石墨烯量子點(diǎn)/玻碳電極(RGOQDs/GCE)的細(xì)胞電化學(xué)法研究了芴作用下2種細(xì)胞核苷酸代謝過程中黃/鳥嘌呤含量的變化，對(duì)比芴對(duì)2種細(xì)胞活性的影響，并與MTT法對(duì)比。本研究為PAHs的毒性評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(BALB/c 3T3)購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)(中國(guó))；中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(V79)購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)(中國(guó))；芴(Flu)購(gòu)自中國(guó)Aladdin公司；黃嘌呤(X)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鳥嘌呤(G)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；青霉素/鏈霉素混合溶液(penicillin-streptomycin solution)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(中國(guó))；胰蛋白酶(C6H15O12P3)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(中國(guó))；胎牛血清(FBS)購(gòu)自上海雙洳生物科技有限公司(中國(guó))；三蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制；DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；非必需氨基酸(nonessential amino acid)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(中國(guó))；其他試劑均為分析純。

恒電位儀(CHI 615，辰華儀器有限公司，中國(guó))；高效液相色譜儀系統(tǒng)(G1311Agilent 1100，安捷倫科技有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Multiskan FC，美國(guó)Bio Tek公司)；微量移液器(P型，Eppendorf公司，德國(guó))；三重純水蒸餾器(SZ-97，上海亞榮生化儀器廠，中國(guó))；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(311，美國(guó)Thermo公司)；超潔凈工作臺(tái)(VS-1300U，蘇州華宇凈化設(shè)備有限公司，中國(guó))；玻碳電極(φ=5 mm)、Ag/AgCl/KClsat(R1000)、鉑絲電極(1 mm×10 mm)均購(gòu)自武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司(中國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與收集

配制10%胎牛血清、1% 100 μg·mL-1青霉素/鏈霉素、1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用原位細(xì)胞裂解法[9]進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，每皿細(xì)胞的培養(yǎng)基吸去，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗培養(yǎng)皿一次，再加入一定量的PBS，于恒溫水浴鍋中50 ℃原位裂解30 min后進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

加藥組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞分別在含芴和二甲基亞砜(DMSO)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，DMSO的含量低于0.1%。

1.3 MTT試驗(yàn)

將濃度為1×104cells·mL-1的細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后，加藥組細(xì)胞加入含不同濃度芴的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含DMSO培養(yǎng)基，空白對(duì)照組只加入培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL的MTT，培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入DMSO，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(A)[10-11]。

細(xì)胞毒性公式：

式中：Acontrol、Aexp、Ablank分別為對(duì)照組、加藥組和空白對(duì)照組吸光度值。

1.4 電化學(xué)檢測(cè)方法

利用RGOQDs/GCE工作電極、Ag/AgCl/KClsat和鉑絲對(duì)電極組成的三電極體系，使用差分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，電位范圍0.4～0.9 V。

細(xì)胞毒性公式[11]：

式中：ip,control和ip,exp分別為對(duì)照組和加藥組細(xì)胞裂解液的電流強(qiáng)度。

1.5 高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)

檢測(cè)條件：Ascenis RP-Amide色譜柱(4.0 mm×1 250 mm×15.0 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫25 ℃；流動(dòng)相0.02 mol·L-1的KH2PO4溶液(pH 4.9)；流動(dòng)相流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

文中數(shù)據(jù)為5次測(cè)定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用Origin 2018軟件作圖，SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 HPLC法確定BALB/c 3T3和V79細(xì)胞的電化學(xué)信號(hào)來源

利用HPLC外標(biāo)法確定BALB/c 3T3和V79這2種細(xì)胞裂解液的電化學(xué)信號(hào)來源。UA、G和X標(biāo)準(zhǔn)品(圖1 (a))的保留時(shí)間分別為8.707、13.730和15.210 min，與BALB/c 3T3細(xì)胞裂解液(圖1(b))的保留時(shí)間8.755、13.937和15.357 min吻合，與V79細(xì)胞裂解液(圖1(c))的保留時(shí)間8.788、13.962和15.382 min亦吻合，這說明BALB/c 3T3和V79這2種細(xì)胞中均含有UA、G和X這3種物質(zhì)。

2.2 芴作用時(shí)間對(duì)BALB/c 3T3細(xì)胞的影響

通過考察不同作用時(shí)間下1 mmol·L-1芴對(duì)BALB/c 3T3細(xì)胞G/X氧化峰電流的影響，得到相應(yīng)的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。圖2(a)為加藥組和對(duì)照組細(xì)胞的G/X氧化峰電流隨作用時(shí)間變化圖，加藥組細(xì)胞的G/X氧化峰電流均低于對(duì)照組，可能芴的存在抑制了細(xì)胞中G/X的產(chǎn)生。加藥組和對(duì)照組細(xì)胞的G/X氧化峰電流均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，對(duì)照組細(xì)胞的G/X氧化峰電流培養(yǎng)至30 h后開始降低，可能是培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡；加藥組細(xì)胞的G/X氧化峰電流24 h后呈下降趨勢(shì)，且加藥組與對(duì)照組細(xì)胞的G/X氧化峰電流差值在30 h時(shí)最大。由加藥組和對(duì)照組細(xì)胞的G/X氧化峰電流計(jì)算出芴在不同作用時(shí)間下的細(xì)胞毒性，如圖2 (b)所示，隨著芴作用時(shí)間的增加細(xì)胞毒性增強(qiáng)，在30 h處達(dá)到最大值，為最佳作用時(shí)間。

圖1 不同樣品的HPLC圖注：(a) 35 μg·mL-1尿酸(UA)、10 μg·mL-1鳥嘌呤(G)和10 μg·mL-1黃嘌呤(X)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品；(b) BALB/c 3T3細(xì)胞裂解液， 細(xì)胞濃度4×106 cells·mL-1；(c) V79細(xì)胞裂解液，細(xì)胞濃度4×106 cells·mL-1。Fig. 1 HPLC chromatograms of different samplesNote: (a) the mixture of 35 μg·mL-1 uric acid (UA), 10 μg·mL-1 guanine (G) and 10 μg·mL-1 xanthine (X); (b) BALB/c 3T3 cell suspension, cell concentration 4×106 cells·mL-1; (c) V79 cell suspension, cell concentration 4×106 cells·mL-1.

2.3 芴作用劑量對(duì)BALB/c 3T3細(xì)胞的影響

通過考察不同劑量芴對(duì)BALB/c 3T3細(xì)胞G/X氧化峰電流的影響，得到相應(yīng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系，并利用MTT法驗(yàn)證電化學(xué)法的準(zhǔn)確性。圖3(a)為不同劑量芴作用下BALB/c 3T3細(xì)胞G/X氧化峰電流的變化圖，隨著作用劑量的增加，BALB/c 3T3細(xì)胞的G/X氧化峰電流降低，說明隨著細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中芴劑量的增加，細(xì)胞的嘌呤核苷酸代謝被抑制，BALB/c 3T3細(xì)胞的G/X含量減少。由不同劑量芴作用下BALB/c 3T3細(xì)胞的G/X氧化峰電流變化得到對(duì)應(yīng)的毒性曲線，半數(shù)抑制效應(yīng)濃度(IC50)值為0.89 mmol·L-1。利用基于RGOQDs/GCE的細(xì)胞電化學(xué)法得到的毒性曲線與MTT法測(cè)得的毒性曲線趨勢(shì)一致，如圖3(b)所示，且電化學(xué)法測(cè)得的IC50值低于MTT法(1.34 mmol·L-1)，說明該電化學(xué)法有望成為毒性評(píng)價(jià)的可靠方法。

圖2 芴作用時(shí)間對(duì)加藥組和對(duì)照組細(xì)胞氧化峰電流的影響(a)及與BALB/c 3T3細(xì)胞毒性的關(guān)系(b)注：嵌圖為0、6、12、18、24、30和36 h對(duì)應(yīng)的電化學(xué)曲線圖，細(xì)胞接種濃度2.0×105 cells·mL-1。Fig. 2 Effect of culture time on cell oxidation peak currents in the drug group and control group (a) and relationship between fluorene action time and the cytotoxicity to BALB/c 3T3 cells (b) Note: The inset diagram is the corresponding electrochemical curve at 0, 6, 12, 18, 24, 30 and 36 h; cell inoculation concentration is 2.0×105 cells·mL-1.

圖3 不同劑量芴對(duì)BALB/c 3T3細(xì)胞的氧化峰電流的影響(a)以及電化學(xué)法和MTT法檢測(cè)芴 對(duì)BALB/c 3T3細(xì)胞的毒性比較(b)注：嵌圖為0～3.8 mmol·L-1芴作用下對(duì)應(yīng)的電化學(xué)曲線圖；細(xì)胞接種濃度2.0×105 cells·mL-1；芴作用時(shí)間30 h。Fig. 3 Effect of fluorene at different doses on the oxidation peak currents of BALB/c 3T3 cells (a), and cytotoxicity curves of fluorene acted on BALB/c 3T3 cells by the electrochemical method and MTT assay (b)Note: The inset diagram is the corresponding electrochemical curve at 0～3.8 mmol·L-1 concentration of fluorene; cell inoculation concentration is 2.0×105 cells·mL-1; fluorene-treated time is 30 h.

PAHs的細(xì)胞毒性并不強(qiáng)，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中需要加入代謝活化系統(tǒng)，PAHs被細(xì)胞加氧酶分解生成的環(huán)氧化物、二酮等化合物的細(xì)胞毒性較強(qiáng)。顧祖維[12]利用微核試驗(yàn)對(duì)苯并[a]芘、黃曲霉毒素、聯(lián)苯胺、3-甲基膽蒽和N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍等致癌物的遺傳毒性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，BALB/c 3T3細(xì)胞不加入代謝活化系統(tǒng)，其自身就能代謝這些物質(zhì)而顯現(xiàn)出明顯的遺傳毒性。Colacci等[13]研究了3-甲基膽蒽和苯并[a]芘的對(duì)BALB/c 3T3 A31-1-1細(xì)胞的“三致效應(yīng)”，發(fā)現(xiàn)不需要加入代謝活化系統(tǒng)，2種化合物就有較強(qiáng)的致癌作用。因此，對(duì)芴的BALB/c 3T3細(xì)胞毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)時(shí)，不僅考慮芴的作用，還要考慮芴在細(xì)胞中發(fā)生代謝后產(chǎn)物的毒性作用。

圖4 芴作用時(shí)間對(duì)加藥組和對(duì)照組細(xì)胞氧化峰電流的影響(a)及與V79細(xì)胞毒性的關(guān)系(b)注：嵌圖為0、6、12、18、24、30和36 h對(duì)應(yīng)的電化學(xué)曲線圖，細(xì)胞接種濃度2.0×105 cells·mL-1。Fig. 4 Effect of culture time on cell oxidation peak currents in the drug group and control group (a) and relationship between fluorene action time and the cytotoxicity to V79 cells (b) Note: The inset diagram is the corresponding electrochemical curve at 0, 6, 12, 18, 24, 30 and 36 h; cell inoculation concentration is 2.0×105 cells·mL-1.

圖5 不同劑量芴對(duì)V79細(xì)胞的氧化峰電流的影響(a)以及電化學(xué)法和MTT法檢測(cè)芴對(duì)V79細(xì)胞的毒性比較(b)注：嵌圖為0～1.5 mmol·L-1芴作用下對(duì)應(yīng)的電化學(xué)曲線圖；細(xì)胞接種濃度2.0×105 cells·mL-1；芴作用時(shí)間30 h。Fig. 5 Effect of fluorene at different doses on the oxidation peak currents of V79 cells (a), and cytotoxicity curves of fluorene acted on V79 cells by the electrochemical method and MTT assay (b)Note: The inset diagram is the corresponding electrochemical curve at 0～1.5 mmol·L-1 concentration of fluorene; cell inoculation concentration is 2.0×105 cells·mL-1; fluorene-treated time is 30 h.

2.4 芴作用時(shí)間對(duì)V79細(xì)胞的影響

考察不同作用時(shí)間下0.3 mmol·L-1芴對(duì)V79細(xì)胞G/X氧化峰電流的影響，進(jìn)而得到相應(yīng)的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。圖4(a)為加藥組和對(duì)照組細(xì)胞的G/X氧化峰電流隨作用時(shí)間變化圖，加藥組細(xì)胞的G/X氧化峰電流均低于對(duì)照組，可能芴的存在抑制了細(xì)胞中G/X的產(chǎn)生。對(duì)照組細(xì)胞的G/X氧化峰電流隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，培養(yǎng)至30 h后開始降低，可能是培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡；而加藥組細(xì)胞的G/X氧化峰電流在初期呈下降趨勢(shì)，6 h后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，培養(yǎng)至30 h后開始降低，且加藥組與對(duì)照組細(xì)胞的G/X氧化峰電流差值在30 h時(shí)最大。由加藥組和對(duì)照組細(xì)胞的G/X氧化峰電流計(jì)算出芴在不同作用時(shí)間下的細(xì)胞毒性，如圖4(b)所示，隨著芴作用時(shí)間的增加細(xì)胞毒性增強(qiáng)，在30 h處達(dá)到最大值，為最佳作用時(shí)間。

2.5 芴作用劑量對(duì)V79細(xì)胞的影響

考察不同劑量芴對(duì)V79細(xì)胞G/X氧化峰電流的影響，并利用MTT法驗(yàn)證電化學(xué)法的準(zhǔn)確性，得到芴的V79細(xì)胞劑量-效應(yīng)關(guān)系。圖5(a)為不同劑量芴作用下V79細(xì)胞G/X氧化峰電流的變化圖，當(dāng)芴的作用劑量為0.010 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞的G/X氧化峰電流明顯下降，說明少量的芴便影響了細(xì)胞的嘌呤核苷酸代謝；隨著芴作用劑量的增加，V79細(xì)胞的G/X氧化峰電流降低，說明隨著細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中芴劑量的增加，細(xì)胞的嘌呤核苷酸代謝被抑制，V79細(xì)胞的G/X含量減少。由不同劑量芴作用下V79細(xì)胞的G/X氧化峰電流變化得到對(duì)應(yīng)的毒性曲線，IC50值為0.25 mmol·L-1。利用基于RGOQDs/GCE的細(xì)胞電化學(xué)法得到的毒性曲線與MTT法測(cè)得的毒性曲線趨勢(shì)一致，如圖5(b)所示，且電化學(xué)法測(cè)得的IC50值低于MTT法(0.86 mmol·L-1)，說明電化學(xué)法的靈敏度高于MTT法。劉云崗等[14]在對(duì)青石棉的細(xì)胞毒性研究中發(fā)現(xiàn)，青石棉對(duì)V79細(xì)胞的毒性要強(qiáng)于BALB/c-3T3細(xì)胞。由于不同類型細(xì)胞的代謝途徑不同，使得芴作用下2種細(xì)胞的IC50值有一定的差異，芴對(duì)V79細(xì)胞毒性的IC50值更小，說明芴對(duì)V79細(xì)胞的毒性更強(qiáng)。

3 討論(Discussion)

本文研究了芴對(duì)BALB/c 3T3和V79這2種細(xì)胞毒性的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)，利用基于RGOQDs/GCE的細(xì)胞電化學(xué)法測(cè)得的IC50值為0.89 mmol·L-1和0.25 mmol·L-1，MTT法測(cè)得的IC50值為1.34 mmol·L-1和0.86 mmol·L-1。2種方法測(cè)得的BALB/c 3T3細(xì)胞的IC50值均大于V79細(xì)胞的IC50值，說明芴對(duì)V79細(xì)胞的毒性更強(qiáng)；電化學(xué)法測(cè)得的IC50值要小于MTT法測(cè)得的IC50值，說明電化學(xué)法的靈敏度要更高一些。p53基因具有基因調(diào)節(jié)作用并參與DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯、凋亡等，而具有基因毒性的PAHs類物質(zhì)會(huì)激活細(xì)胞中的p53基因進(jìn)而影響細(xì)胞周期。Chramostová等[15]通過研究PAHs對(duì)不同細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)胞類型不同，在G1期阻滯、S期延長(zhǎng)或細(xì)胞凋亡等方面有一定差異，所示不同細(xì)胞在代謝產(chǎn)物上也不同。