miR-765通過調控線粒體自噬的發生促進多發性骨髓瘤的發生發展

龍石峰　龍生平　賀紅蕾

摘要：目的：探討miR-765對線粒體自噬發生的調控關系，以及對多發性骨髓瘤的發生發展的影響。方法：通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（RFQ-PCR）及蛋白質印跡western bot試驗技術測定靶基因及靶自噬關鍵蛋白的準確含量。結果：多發性骨髓瘤患者化療前miR-765及自噬關鍵蛋白表達水平變化均顯著高于正常對照（P<0.05），miR-765和自噬關鍵蛋白表達水平變化具有正相關性。結論：miR-765可以調控線粒體自噬的發生，而通過調控線粒體自噬的發生進一步影響多發性骨髓瘤的發生和發展。

關鍵詞：線粒體自噬;多發性骨髓瘤;蛋白質印跡試驗western bot

【中圖分類號】R730.4???????????? 【文獻標識碼】A???????????? 【文章編號】2107-2306（2021）12--02

引言

多發性骨髓瘤是一種以骨髓漿細胞惡性克隆性增殖為特征的B淋巴細胞惡性腫瘤，與骨髓基質細胞密切相關?-?。其自分泌或旁分泌可溶性細胞，這些細胞分泌細胞因子調控線粒體自噬的發生促進多發性骨髓瘤的發生發展?-??。細胞因子中即包括miR-765蛋白，其為TNF家族新成員，因具有促進腫瘤細胞增殖作用而命名，為幼稚、原始及活化B淋巴細胞的主要調控線粒體自噬的發生促進多發性骨髓瘤的發生發展因子之一。

Western Blot它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種蛋白質印跡法實驗方法。現已廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。

在多發性骨髓瘤細胞受外源性調控線粒體自噬激活的各種信號途徑中，NF-кB 途徑可能是最主要的途徑之一。目前研究已證實，能直接激活NF-кB途徑的miR-765，已經被確認是多發性骨髓瘤細胞的主要存活調控線粒體自噬的發展發生促進多發性骨髓瘤的發生因子及生長調控線粒體自噬的發展發生促進多發性骨髓瘤的發生因子，骨髓瘤細胞系及幼稚骨髓瘤細胞高表達miR-765。miR-765被發現具有保護多發性骨髓瘤、B-CLL細胞避免自發性凋亡及藥物誘導性凋亡作用，同時可提高其細胞存活能力。故目前認為，對miR-765的研究極有可能成為腫瘤，尤其是B淋巴細胞惡性腫瘤研究的新方向。

本研究采用RFQ-PCR及western bot試驗技術，測定不同分期多發性骨髓瘤首次就診及應用一周期VAD方案化療后患者外周血血漿中自噬關鍵蛋白及單個核細胞中miR-765的表達發展情況，并歸納總結miR-765表達發展與多發性骨髓瘤不同分期及化療前后間的關系，以期在多發性骨髓瘤早期診斷、早期治療、預測疾病活動以及尋找預后生物參數等方面發揮重要作用，并為臨床治療新方法提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

62份標本均取自井岡山大學附屬醫院血液科2020年4月～2021年5月住院的31例初診及一周期VAD方案化療后患者外周血。其中男22例， 女9例，中位年齡65歲（46～82歲）。多發性骨髓瘤 Ⅰ期6例，Ⅱ期9期，Ⅲ期16例，其中A組12例，B組19例。15份健康供者標本，中位年齡69歲（55～80歲）。多發性骨髓瘤分型、療效標準及疾病診斷采用《血液病診斷及療效標準》，由張之南主編。多發性骨髓瘤分期按國際分期系統（ISS）進行。

1.2 western bot（蛋白質印跡法）材料

限制性內切酶、T4 DNA連接酶; pGEM-T載體試劑盒;Trizol 試劑;X-gal、Taq DNA聚合酶;逆轉錄試劑盒（Qiagen公司）;DL-2000;膠回收試劑盒;ELISA試劑盒、自噬關鍵蛋白紫外分析儀、熒光定量PCR儀、全自動酶標儀。

1.3 western bot試驗（蛋白質印跡法）

1.3.1制備標本

取化療前及后患者外周血6 mL，應用EDTA抗凝， 2 mL提取血漿，4 mL分離出單個核細胞。

1.3.2設計探針及引物

據注冊號為NM012512的自噬關鍵蛋白（Pink1，parkin NIX） 全序列（內參）和miR-765 （注冊號為AF04688 ），設計相應引物和熒光探針并合成。

1.3.3 構建調控線粒體自噬基因（miR-765）及內參β-ACTIN及自噬關鍵蛋白（Pink1，parkin NIX）標準品

細胞總RNA經Trizol法提取后檢測其濃度和純度，并進行逆轉錄反應， cDNA進行擴增目的片段，膠回收電泳PCR產物與T載體連接，連接產物經過藍白斑western bot試驗篩選出重組質粒，提取出小量，陽性克隆經EcoRⅠ酶切western bot試驗鑒定、測序分析證實后進一步擴增，質粒抽提，再經自噬關鍵蛋白紫外分析儀定量，按倍比稀釋后保存。

1.3.4 RFQ-PCR檢測miR-765含量

在離心管中加入反應體系，并設5個miR-765標準品、空白管及陰性管各3個復孔作為對照。PCR 擴增在熒光定量檢測儀中進行。由電腦軟件計算出標本中miR-765值， 將miR-765與Pink1，parkin NIX比值定為評估miR-765表達水平變化的標值。

1.3.5? western bot方法檢測自噬關鍵蛋白含量

western bot方法檢測自噬關鍵蛋白（Pink1，parkin NIX）含量，嚴格按照說明書執行，測定靶自噬關鍵蛋白含量。

1.4 統計學處理

采用Stata7.0統計學軟件進行數據處理。數據以均數±標準差（）表示，正常對照及多發性骨髓瘤患者化療前不同分期、多發性骨髓瘤患者化療后不同療效miR-765和自噬關鍵蛋白的表達發展比較均采用單因素方差分析，如差異有統計學實際實踐的價值，進一步兩兩比較采用Scheffe法，P<0.05。

2 結果

2.1 總RNA的純度和質量

細胞總RNA檢測表明，提示質量及完整性均良好。

2.2 PCR擴增產物電泳檢測

擴增產物經電泳檢測， 結果表明片段大小符合預期值。

2.3 western bot試驗鑒定陽性克隆

將藍白斑western bot試驗篩選出的重組質粒， 抽提出小量，EcoRⅠ內切酶，western bot試驗鑒定陽性克隆后測序分析，顯示與Pink1，parkin NIX及miR-765的基因序列相符，同源性達100%。

2.4 ELISA檢測的線性關系

miR-765標準品經酶標儀測定OD值，得出標準曲線，顯示不同標準品濃度與相應OD值之間存在良好的線性相關（r=1%）。

2.5 基因miR-765通過調控線粒體自噬及自噬關鍵蛋白測定結果

結果表明：對照組與多發性骨髓瘤患者化療前各期miR-765及自噬關鍵蛋白表達發展均采用單因素方差分析比較有統計學差異（miR-765 F=4.28，P=0.0275; miR-765自噬關鍵蛋白F=5.11，P=0.0157），Scheffe法進一步兩兩比較顯示：各期miR-765及自噬關鍵蛋白水平均顯著高于正常對照（P<0.05）

3 討論

在過去的幾年中，努力尋找識別多發性骨髓瘤高危人群的預后指標及明確促進多發性骨髓瘤細胞惡性增殖及耐藥發生的一系列復雜機制的研究已大量開展，最近研究顯示，miR-765在B細胞的生成、免疫耐受及惡性克隆性增殖等方面均發揮重要作用。在正常生理狀態下，miR-765是骨髓中漿細胞不可缺少的調控線粒體自噬的發生促進多發性骨髓瘤的發展發生因子。研究顯示，分泌大量miR-765的巨核細胞，對漿細胞而言是必不可少的骨髓組成部分，間接表明漿細胞存活有賴于miR-765。這些選擇性局灶性分泌的miR-765可能對骨髓中淋巴系統惡性腫瘤的存活起至關重要的作用。多項研究已證實miR-765在腫瘤疾病中發揮重要作用，尤其是B細胞惡性腫瘤。人miR-765 轉染的小鼠，大約40%最終發展為類似于B-CLL的B細胞惡性腫瘤。

在我們的研究中發現，多發性骨髓瘤患者miR-765血清自噬關鍵蛋白表達水平變化明顯高于正常對照，與文獻報道相一致，且miR-765表達發展與自噬關鍵蛋白水平表達發展一致。更重要的是，我們證實，多發性骨髓瘤分期越高，其miR-765及自噬關鍵蛋白表達表達水平變化越高，Ⅲ期明顯高于Ⅰ期及Ⅱ期，化療后表達表達水平變化下降，與文獻報道相一致，具體數據另篇論文詳細敘述。我們進一步將化療后不同療效進行比較發現，PD組顯著高于CR及PR組（P<0.05）。

主要數據分析表明，miR756的表達水平的變化和線粒體自噬蛋白水平變化有明顯相關性，miR756能調控線粒體自噬，通過調控線粒體自噬影響多發性骨髓的發生和發展，分析與研究體現miR756，自噬，多發性骨髓瘤三者間的關系。

在本研究中，患者中 血清 miR-765表達水平顯著低于對照組，且ISS分期Ⅲ期患者顯著低于I/Ⅱ期患者（P<0.05），此外 miR-765的表達水平與多發性骨髓瘤的髓外浸潤相關?[10]（P<0.05）。miR-765位于人類染色體17pl31，在幾乎所有人體器官和組織中均有表達. 例如大腦、乳腺、肺、胃和血液等?。目前已有大量的研究指出 miR-765 在多種腫瘤類型中的處于失常的狀態，從而促進腫瘤疾病進程發展?。例如，Han等人發現，在 ERα陰性乳腺癌中，miR-765的表達量降低通過增加的 MIF表達和增強 患者P9 活性，促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。Zhang 等1n報道，miR-765通過直接靶向 E2F3基因抑制人膀胱癌移行細胞的增殖、遷移和侵襲。Ge 等報道，在骨肉瘤細胞中miR-765過表達能夠抑制細胞增殖，克隆形成，遷移和侵襲，誘導細胞凋亡和細胞周期停滯。并且在裸鼠模型中miR-765的過表達能夠抑刺腫瘤生長。提示miR-765與腫瘤患者疾病進程顯著相關，可能可以用于腫瘤患者的診斷或早期診斷。

圖2 miR-765表達水平與無事件生存期之間的關系

ROC曲線分析結果指出，miR-765 的表達含量對 患者 患者和對照組的簽別能力良好，miR-765的曲線下面積（AUC）為0.9333，觸感性為86%，特異性為96%，95%置信區間（CI）0. 886-0.981∶P<0.0017。此外，20個月的隨訪指出，miR-765低表達組的無事件生存期顯著高于miR-765 高表達組。指出 血清中 miR-765的表達水平與患者的預后相關。總之，本研究表明血清中 miR-765 的表達水平可用作生物標志物幫助 患者中的診斷和預測。miR-765 可用于鑒定預后不良的患者，有助于及時選擇合適的治療方案。

結論：

綜上所述，我們的結果已顯示，miR-765及自噬關鍵蛋白表達水平是提示多發性骨髓瘤疾病發生和進展的有重要意義的生物學指標。miR-765表達水平變化是調控線粒體自噬的發生促進多發性骨髓瘤的發生發展的重要因素。miR-765水平檢測可以作為多發性骨髓瘤的診斷、早期治療及預后的新指標，且可能成為有效治療的新靶點。

參考文獻：

[1] Caers J，Van Valckenborgh E， Menu E，et al. Unraveling the biology of multiple myeloma disease：cancer stem cells，acquired intracellular changes and interactions with the surrounding microenvironment[J]. Bull Cancer，2020， 95：301-313.

[2] Schneider P，MacKay F，Steiner V，et al. BAFF，a novel ligand of the tumor necrosis factor family，stimulates B cell growth[J]. J Exp Med，2021，189（11）：1747-1756.

[3] Tai YT， Li XF， Breitkreutz I， et al. Role of B-cell-activating factor in adhesion and growth of human multiple myeloma cells in the bone marrow microenvironment[J]. Cancer Res，2020，66（13）：6675-6682.

[4] Mitsiades CS， Mitsiades N， Poulaki V，et al. Activation of NF-kappa B and upregulation of intracellular antiapoptotic proteins via the IGF-1/Akt signaling in human multiple myeloma cells： therapeutic implications[J]. Oncogene，2020，21（37）：5673-5683.

[5] Novak AJ， Darce JR， Arendt BK， et al. Expression of BCMA， TACI， and BAFF-R in multiple myeloma： a mechanism for growth and survival[J]. Blood，2020，103：689-694.

[6] Kern C，Cornuel JF，Billard C，et al. Involvement of BAFF and miR-765 in the resistance to apoptosis of B-CLL through an autocrine pathway[J]. Blood，2020，103： 679-688.

[7] Briones J，Tierman JM，Hilbert DM，et al. BLyS and BLyS receptor expression in non-Hodgkin’s lymphoma[J]. Exp Hematol， 2020，30：135-141.

[8] Bonci D， Hahne M， Felli N，et al. Potential role of miR-765 as autocrine growth factor for megakaryocytopoiesis[J]. Blood，2020，104（10）：3169-3172.

[9] Winter O， Moser K， Mohr E，et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow[J]. Blood， 2018，116（11）：1867-1875.

[10] Dorota Lemancewicza，Lukasz Bolkunb，Ewa Jablonskac，et al. Evaluation of TNF superfamily molecules in multiple myeloma patients：Correlation with biological and clinical features[J]. Leukemia Research，2021，5（14）：1-5.

[11] Dillon S，Gross J，Ansell SM，et al. An miR-765 to remember： novel TNF ligands as therapeutic targets[J]. Nat Rev，2020，5：235-246.

[12] Hendriks J，Planelles L，De Jong-Odding J，et al. Heparan sulphate proteoglycan binding promotes miR-765-induced tumor cell proliferation[J]. Cell Death Diff，2020， 12：637-648.

[13] Fragioudaki M， Tsirakis G，Pappa CA，et al. Serum BAFF levels are related to angiogenesis and prognosis in patients with multiple myeloma[J]. Leuk Res，2021，36（8）：1004-1008.

[14] Breitkreutz I，Raab MS，Vallet S，et al. Targeting MEK1/2 blocks osteoclast differentiation function and cytokine secretion in multiple myeloma[J]. Br J H aematol，2020， 139：55-63.

[15] Marco Guadagnoli， Fiona Kimberley， Uyen Phan， et al. Development and characterization of miR-765 antagonistic monoclonal antibodies for treatment of B-cell lymphomas[J]. Blood，2018， 69：2900-2905.

作者簡介：第一作者，姓名：龍石峰，職稱：副主任醫師 科室：血液科，出生年月：1975-11-20，井岡山大學附屬醫院343000。