魔芋莖腐病發病程度對其根際微生物群落結構的影響

趙興麗， 張 莉， 羅林麗， 周羅娜， 賀圣凌， 張 欣， 周玉鋒

(1.貴州省農業科學院 生物技術研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農業科學院 草業研究所， 貴州 貴陽 550006； 3.貴州省農業科學院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】魔芋經濟價值很高，其塊莖含有豐富的葡甘聚糖，具有良好的營養和保健特性[1-3];可以食用或釀酒，具有降血脂、血清膽脂及消腫攻毒之功效[4]，還具有抗糖尿病的作用[5-8]，對人體皮膚也具有益處[9]，同時還是重要的添加劑和化工原料[10]。魔芋具有較好的市場需求，現實卻供不應求，原因是魔芋土傳病害(軟腐病、根/莖腐病、白娟病等)是制約其擴大種植規模的重要原因之一。魔芋莖腐病是由鐮刀菌(Fusariumspp.)侵染引起的一種真菌性病害，主要危害地下塊莖，發病初期為褐色水浸漬病斑，根部、塊莖腐爛變黑，植株生長矮小，葉片發黃，后期葉柄枯萎，嚴重時整個植株死亡[11]。鐮刀菌(Fusariumspp.)是土壤習居菌，既可以在病殘體上生存，也可單獨在土壤中以休眠態存活多年[12]，待溫濕度條件滿足時，病菌便侵染魔芋根系和塊莖致使植株發病。病原菌在長期進化和生存競爭中，可與根際土壤中有益微生物形成互生、共生、寄生、競爭、拮抗及吞食等關系[13]；其中有益微生物通過養分競爭、拮抗作用、誘導系統抗性和重寄生作用等機制抑制土壤中的病菌、促進植物生長[14]；而病原菌的大量積累將導致植株死亡[15]。了解魔芋莖腐病不同發病程度下根際土壤微生物(尤其是有益微生物)的變化，不僅可為魔芋-土壤-微生物的互作關系提供理論依據，且對指導魔芋土傳病害防治具有現實意義。【前人研究進展】影響魔芋根際土壤微生物群落結構的因素較多，如海拔、種植年限及種植模式等[16-18]。研究表明，隨著海拔高度的增加，魔芋根際土壤中細菌、真菌、放線菌和微生物總量均相應增加[19]；長期連作魔芋根際土壤細菌數量增多、真菌和放線菌數量卻減少[20]；魔芋與不同作物或林木套種后發現，林下魔芋土壤微環境優于大田。進一步研究還發現，施用有益微生物也會引起魔芋根際土壤微生物群落結構的變化[21-22]。【研究切入點】隨著土壤微生物群落研究的發展，傳統的分子生物學方法因費力、昂貴、耗時，并且分辨率較低等特點[23]，逐漸被高通量測序技術(Illumina Mi Seq)等新測序技術所代替。雖然，前人已采用高通量測序技術對魔芋不同海拔、連作、套種以及施用有益微生物等條件下根際微生物群落結構和多樣性進行研究，但有關魔芋莖腐病發病程度下根際微生物群落結構和多樣性的研究還未見報道。【擬解決的關鍵問題】以魔芋莖腐病為對象，利用高通量測序技術測定輕度發病、中度發病、重度發病情況下根際微生物群落結構和多樣性；比較不同發病程度下魔芋根際土壤中有益微生物的變化，探析魔芋莖腐病發病程度對其根際有益微生物的影響，以期為利用土壤微生物多樣性和有益微生物防控魔芋莖腐病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 土樣采自貴州省獨山縣苗泥村(東經107.61°、緯度25.86°)魔芋種植地，品種為花魔芋。參照軟腐病的分級標準[24]將魔芋莖腐病發病程度分為輕度、中度和重度3個等級，每個等級各選擇3株植株，去掉其根際表層土壤后，取魔芋塊莖周圍的土壤，混勻，無菌自封袋保存，帶回實驗室備用。

1.1.2 試劑 引物[真菌ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)、細菌338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)、古細菌524F10extF(5′-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3′)和Arch958RmodR(5′-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3′)]以及試劑(10×Buffer、2.5 mM dNTPs、rTaq Polymerase、BSA、Template DNA)，均由上海美吉生物醫藥科技有限公司提供。

1.1.3 儀器設備 pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)，TU-1901紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，TAS-990F原子吸收分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，Optima 8000電子耦合等離子體發射光譜儀(Perkin Elmer)。

1.2 方法

1.2.1 魔芋根際土壤含水量、pH及養分含量測定 稱取一定量的土樣置于60℃的烘箱中烘干，通過土壤鮮重和干重統計土壤的含水量；取5 g土壤加入到裝有45 mL無菌水的錐形瓶中，150 r/min震蕩30 min，使土壤完全溶解于水中，pH計檢測土壤懸液的pH。采用酸式滴定管測定土壤全氮，采用紫外可見分光光度計測定土壤中磷的含量，采用原子吸收分光光度計測定土壤中鉀和有效磷的含量，采用電子耦合等離子體發射光譜儀測定土壤中速效鉀的含量。3次重復，取平均值。

1.2.2 魔芋根際土壤高通量測序 分析天平稱取0.5 g魔芋根際土壤樣品，提取土壤總DNA，使用引物ITS1F和ITS2R、338F和806R以及524F10extF和Arch958RmodR分別擴增真菌ITS1F-ITS2R區域、細菌338F-806R區域以及古細菌524F10extF-Arch958RmodR區域的基因片段。PCR體系(20 μL)：10×Buffer，2 μL；2.5 mM dNTPs，2 μL；上游引物0.8 μL；下游引物 0.8 μL；rTaq Polymerase 0.2 μL；BSA 0.2 μL；Template DNA 10 ng，補水至20 μL。PCR反應程序：真菌和古細菌(95℃預變形3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環35次，72℃延伸10 min，10℃保存)；細菌(95℃預變形3 min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循環27次，72℃延伸10 min，10℃保存)。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用Quanti FluorTM-ST(Promega，USA)系統定量檢測PCR產物濃度，依托上海美吉生物醫藥科技有限公司使用Illumina Miseq 300平臺對樣品進行高通量測序。最終數據利用云平臺(https：//www.i-sanger.com)進行OTU聚類分析和物種分類學分析。為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在Domain(域)，kingdom(界)，Phylum(門)，Class(綱)，Order(目)，Family(科)，Genus(屬)，Species(種)等水平統計各樣本的群落物種組成。組間顯著性差異檢驗根據得到的群落豐度數據，運用Kruskal-Wallis秩和檢驗(Kruskal-Wallis H test)方法，對不同組微生物群落之間的物種進行假設檢驗，評估物種豐度差異的顯著性水平，獲得組間顯著性差異物種。

1.3 數據統計與分析

采用WPS 2007及DPS 7.05對土壤養分及根際微生物屬水平上各類真菌、細菌以及古細菌的相對豐度以及多樣性進行分析。細菌和古菌16S rRNA采用Silva數據庫(Release132 http：//www.arb-silva.de)進行比對；真菌ITS采用Unite數據庫(Release 7.2 http：//unite.ut.ee/index.php)進行比對。

2 結果與分析

2.1 魔芋根際土壤的含水量、pH及養分含量

從表1看出，魔芋不同發病程度其土壤含水量為79.28～84.61%，表現為中度>重度>輕度，其中，中度發病土壤的含水量顯著高于輕度發病土壤，其余發病程度土壤間無顯著差異。魔芋不同發病程度其土壤pH為5.11～5.22，表現為輕度>中度>重度，各發病程度土壤間差異顯著。魔芋不同發病程度土壤中氮的含量存在明顯差異，表現為中度>重度>輕度，中度發病土壤的氮含量顯著高于輕度發病土壤，其余發病程度土壤間無顯著差異；魔芋不同發病程度其土壤中磷、鉀、有效磷以及速效鉀的含量均無顯著性差異，其中鉀和有效磷的含量均表現為輕度>中度>重度，速效鉀的含量表現為重度>輕度>中度。

表 1 魔芋根際土壤的含水量、pH及養分含量

2.2 不同發病程度魔芋根際土壤微生物的多樣性

2.2.1 魔芋根際土壤總DNA的PCR擴增效果 從圖1看出，序號1～9的基因片段經PCR擴增均在250～500 bp獲得相應的條帶，序號10～18的基因片段均在500～750 bp獲得相應的條帶，序號19～27的基因片段均在500 bp左右獲得相應的條帶，其中，除序號1～9的條帶有點拖尾和CK無條帶外，其余條帶都很明亮，說明提取獲得的DNA量能滿足后續測序所需。

注：1～9，擴增ITS基因序列所得產物的凝膠電泳條帶；10～18，擴增16S rRNA片段獲得產物的凝膠電泳條帶；19～27，擴增524F10extF-Arch958RmodR片段獲得產物的凝膠電泳條帶；1～3、10～12及19～21，輕度發病；4～6、13～15及22～24，中度發病；7～9、16～18及25～27，重度發病。

2.2.2 不同發病程度魔芋根際土壤微生物的群落結構 從圖2看出，在屬的分類水平下，不同發病程度魔芋根際土壤中富含多個屬類微生物，其中優勢真菌包括被孢霉屬(Mortierellaspp.)、綠核菌屬(Ustilaginoideaspp.)、毛殼菌屬(Chaetomiaceaespp.)和假單胞菌屬(Pseudeurotiuspp.)等；優勢細菌包括酸桿菌屬(Acidobacterspp.)、黃色桿菌屬(Xanthobacteraceaespp.)、念珠菌屬(Candidatusspp.)、病毒桿菌(Vicinamibacteralesspp.)和緩生根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)等；優勢古細菌包括水生古細菌(Bathyarchaeotaspp.)、亞硝基球菌屬(Nitrococcusspp.)、甲烷胞菌屬(Methanocellaspp.)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcinaspp.)等。各微生物在魔芋根際土壤中的含量存在一定的差異性。

注：A，不同發病程度下魔芋根際土壤真菌群落組成；B，不同發病程度下魔芋根際土壤細菌群落組成；C，不同發病程度下魔芋根際土壤古細菌群落組成。

2.2.3 不同發病程度魔芋根際土壤的微生物多樣性 從表2看出，魔芋根際土壤中真菌、細菌以及古細菌的覆蓋率均大于97.00%，其中，古細菌類群覆蓋率均為100%，真菌覆蓋率均大于99%，細菌類群覆蓋率為97.00%～98.00%，基本涵蓋了各處理魔芋根際土壤中所有真菌、細菌、古細菌類群。豐富度指數中Sobs指數、Ace指數及Chao 1指數均呈細菌>真菌>古細菌，真菌的3個指數均呈重度>輕度>中度，細菌和古細菌的3個指數均呈輕度>中度>重度；發病程度越高，根際土壤中細菌和古細菌的豐富度越低。多樣性指數中香農指數呈細菌>真菌>古細菌，真菌的香農指數均呈重度>中度>輕度，細菌的香農指數呈中度>輕度>重度，古細菌的香農指數呈中度=重度>輕度；辛普森指數呈古細菌>細菌>真菌，真菌的辛普森指數均呈輕度>重度=中度，細菌的辛普森指數呈重度>輕度>中度，古細菌的辛普森指數呈重度>中度=輕度。發病程度對魔芋根際土壤的微生物多樣性具有一定的影響，發病程度越高，魔芋根際土壤真菌的多樣性越高。重度發病區土壤中叢赤殼屬(Nectriaspp.)、芽孢桿菌屬和短根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)的數量分別是輕度發病區的1.22～32.57倍。

表 2 不同發病程度魔芋根際土壤微生物的豐富度指數與多樣性指數

2.2.4 不同發病程度魔芋根際土壤微生物的數量和種類 從圖3看出，不同發病程度魔芋根際土壤中獲得微生物的堿基數和序列數、微生物總量和種類均存在一定的差異。1) 堿基數和序列數。堿基數為15.14×106～15.80×106bp，呈中度>輕度>重度；序列數為71.12×103～72.93×103條，呈輕度>中度>重度；堿基數和序列數各發病程度土壤間無顯著差異。2) 微生物總量。發病程度越高土壤中真菌的數量越多，中度發病區(71.40×103OTUs)、重度發病區(72.33×103OTUs)較輕度發病區土壤中真菌數量(70.49×103OTUs)分別增加2.61%、1.29%；3個發病程度間無顯著差異。細菌數量呈輕度>重度>中度，輕度顯著高于中度，其余處理間差異不顯著。古細菌數量呈中度>輕度>重度，各處理間差異不顯著。3) 微生物種類。古細菌種類為9～14種，發病程度越高土壤中特有古細菌的種類越少，呈輕度>中度>重度；魔芋土壤特有真菌的種類以中等發病區最多，為114種，分別較輕度發病區(37種)和重度發病區(53種)多208.11%和115.09%；魔芋土壤特有細菌的種類以重度發病區最多，為98種，分別較輕度發病區(72種)和重度發病區(59種)多36.11%和66.10%。

注：A，所有微生物的堿基數和序列數；B，微生物總量；C，特有微生物的種類。

2.2.5 不同發病程度魔芋根際土壤有益微生物的差異 從圖4看出，不同發病程度魔芋根際土壤中微生物所占的比例不同，有益微生物和有害微生物在土壤微生物中的比例隨病害程度的變化而變化，魔芋根際土壤中有益真菌包括被孢霉屬(Mortierellaspp.)和叢赤殼屬(Nectriaspp.)；有益細菌包括能促進植物生長或抑制病原菌生長的芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、具有固氮作用的短根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)和芽單胞菌屬(Gemmatimonasspp.)以及能產生抑制病原菌生長的次生代謝物的放線菌門內的Gaiellalesspp.；有害微生物包括鐮刀菌屬(Fusariumspp.)等。隨發病程度加深，有益微生物Gaiellalesspp.和芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)數量呈遞增趨勢；且重度發病區土壤中叢赤殼屬(Nectriaspp.)數量是輕度發病區的32.57倍，芽孢桿菌屬數量是輕度發病區的1.22倍，短根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)數量是輕度發病區的1.31倍。

注：A，真菌組間差異；B，細菌組間差異；C，古細菌組間差異。

3 討論

自2017年以來，魔芋市場需求旺盛，價格飛漲，加工企業對原材料需求量陡增，但魔芋生產基地發展滯后，魔芋加工原料十分短缺，無法滿足企業的基本生產需求[25]。之后的幾年，魔芋市場仍供不應求，因制約魔芋產業發展的重要因素即土傳病害一直未得到有效解決[26]。隨著土壤微生態逐漸被人們所了解，越來越多的研究從單純的拮抗藥劑或拮抗微生物的篩選轉向通過作物根際土壤微生物群落結構變化的角度摸索土傳病害的防治方法，并取得一定的研究成果。研究發現，選擇健康優質的土地進行種植，可減少有害菌數量[27]，種植期間通過改變種植方式(套種、間種、林下種植及輪作等)調節作物根際土壤微生物群落結構和組成，使土壤中有益菌群保持相對平衡，進而減少土傳病害的發生[28]；還可通過減少種植年限，不重茬種植，減少土壤中尖孢鐮刀菌數量以及致病菌所占土壤根際微生物總量的比例，達到減少病害發生的概率[29]。研究還發現，植物在生長過程中常常將許多營養物質分配至根部，并通過其根系向周圍環境釋放大量的單糖、多糖、有機酸、氨基酸、酚類化合物、蛋白質等營養和能源物質，吸引大量微生物聚集[30-32]，這些微生物可通過抗生或誘導植物防御等作用抵御病原菌的侵染[33-34]，對植物起到保護作用。研究表明，魔芋根際微生態對土傳病害的發生有一定的影響，同時魔芋根系也會分泌一定的物質招募大量微生物抵御病原菌的侵染，具體的互作機理尚不清楚。TRIVEDI等[35]研究發現，柑橘黃龍病菌(Candidatusliberbacterasiaticus)侵染柑橘后會改變柑橘根際土壤微生物群落結構和組成，并增加放線菌的聚集。該研究發現，隨著魔芋莖腐病發病程度加深，魔芋根際土壤中有益微生物Gaiellalesspp.和芽孢桿菌屬數量也隨之增加。與TRIVEDI等[35]的研究結果相似。在該研究中，有益微生物Gaiellalesspp.和芽孢桿菌屬的數量受魔芋莖腐病發病程度的影響，是魔芋根系還是鐮刀菌分泌的某種物質吸引其聚集，還是其他不可知的原因，還需深入研究。且魔芋植株遭到病害侵襲時上述有益微生物是否協助防御，并通過有益微生物調控魔芋根際微生物區系，減輕魔芋莖腐病的發生等也需進一步深入研究。

4 結論

魔芋莖腐病發病程度對其土壤pH和養分含量存在一定的差異；魔芋發病程度對其根際土壤微生物群落結構和多樣性具有一定的影響，其中細菌和古細菌的豐富度表現為輕度>中度>重度，真菌多樣性表現為輕度<中度<重度；魔芋發病程度對其根際土壤中獲得微生物的堿基數和序列數、微生物總量和種類也存在一定的影響作用，發病程度越高獲得的序列數以及特有的古細菌數越少；魔芋發病程度對其根際有益微生物的種類和數量也存在一定的影響，其中有益微生物Gaiellalesspp.和芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)數量隨發病程度加重呈遞增趨勢。土壤中叢赤殼屬、芽孢桿菌屬和短根瘤菌屬的數量重度發病區為輕度發病區的1.22～32.57倍。