基于全基因關聯分析的代謝組學在植物中的應用

袁進成, 孟亞軒, 孫穎琦, 趙心月, 王鳳霞, 劉穎慧

(河北北方學院農林科技學院， 河北 張家口 075000)

植物在生長發育的整個生命過程中都會產生大量代謝物，這些代謝物不僅是人類食物和營養物質的重要來源，也在保健和疾病治療中發揮重要作用[1]。植物的代謝物豐富多樣，大約有10～100萬種[2]，大多數代謝物都有物種特異性，有的代謝物還具有發育特異性或組織特異性。隨著代謝物定性和定量檢測技術的快速發展以及測量手段的精細化，人們發現，代謝物的結構和種類遠遠比估計的更多，也更加復雜[3]。由于植物代謝物的多樣性，使得他們成為解析代謝物合成與分解、代謝途徑調控、基因家族解析和比較基因組學的理想標志物。

代謝組是聯系基因組和表型的橋梁。近二十年來，人們越來越關注將代謝組和系統生物學其他方法相結合，以揭示代謝多樣性及潛在的遺傳變異規律。由于復雜樣品快速分析平臺能力的提升，以及代謝組學與其他“組學”和遺傳學的結合，提供了更多解析代謝調控網絡的新方法。

1 代謝組學

代謝組學(metabolomics)是繼基因組學、轉錄組學及蛋白質組學之后興起的又一種系統生物學研究手段，是對某一生物或細胞在某一特定生理時期內所有低分子量代謝產物進行定性和定量分析的一門新學科，對特殊功能的小分子物質進行分析具有突出優勢。代謝組學是對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理、病理變化間關系的一門學科，研究對象為相對分子質量在1 000 以內的小分子物質[4-5]。由于代謝物處于生物系統生化活動調控的末端，基因表達和蛋白質變化對生物系統產生的影響都能在代謝水平得以體現，因此,代謝組學分析所提供的信息能夠揭示生物體內生理和生化功能的狀態，為功能基因組的研究提供便利。目前，隨著國內外生物學研究重心從基因組向功能基因組的轉變，代謝組學在疾病診斷、微生物研究、轉基因作物分析、食品營養與安全等領域得到了廣泛應用。

2 代謝組全基因組關聯分析研究

隨著質譜分析、核磁分析平臺的完善和基因組測序技術的快速發展，全基因組關聯分析和代謝組學相結合，形成代謝組學聯合全基因組關聯分析技術(metabolome-based genome-wide association study，mGWAS)，該技術已經應用到植物代謝組多方面的研究中。mGWAS利用二代測序技術獲得群體材料的基因型數據(genotype)，結合代謝組數據(metabolome)開展基于代謝組學的全基因組關聯分析，有利于批量定位調控代謝物的候選基因，挖掘調控產量、品質和環境應答等相關代謝通路，深入了解植物代謝物合成調控的遺傳機制[1,6]。目前,mGWAS已經成為研究植物代謝物遺傳多樣性的有力工具之一,已經在多個物種中得以應用，為代謝物多樣性的遺傳基礎研究提供了更深入的見解[7]。代謝組學和高通量測序相結合，使得一個物種內或不同物種間代謝物的定量和定性分析成為可能。利用代謝譜分析，結合植物中大量的自然或人工作圖群體進行代謝物的關聯分析，有利于批量挖掘代謝物的調控基因，從而揭示植物代謝物形成的遺傳和生化基礎。

mGWAS是將代謝組數據作為表型，與基因型數據進行關聯分析的一種方法。由于代謝組數據較表型鑒定更為精細，因此關聯分析結果比傳統GWAS精確度更高。mGWAS使用精心設計的方法和作圖群體,為破譯代謝物多樣性的遺傳基礎(尤其是稀有變異)提供了新的方法。基于mGWAS的多維數據分析，對于代謝物遺傳多樣性及其調控機制的理解具有重要意義。mGWAS最早應用于擬南芥中[8]，在擬南芥中將非靶向代謝譜和全基因組關聯分析相結合，利用代謝組學、遺傳學和基因組學相關研究，通過模式植物擬南芥的生物化學和遺傳多樣性來揭示基因和代謝物之間的聯系，將次級代謝物與調控基因聯系起來。這種方法在了解代謝物特性或相關酶生化功能的情況下，有助于研究代謝物與酶之間的關系。利用代謝物與基因型數據通過關聯分析可以挖掘與代謝相關的基因及基因座。與傳統表型 GWAS相比，mGWAS可進行大量代謝產物分析，且精確度較高。由于代謝物的種類、含量在不同品種或個體間具有較大差異性，因此， mGWAS 能夠批量、精準定位候選基因，進而發掘參與代謝調控的功能基因。近年來不斷有mGWAS在植物中應用，并取得顯著的成果[1,7]。

3 mGWAS解讀代謝物的遺傳多樣性

代謝物由酶催化合成,任何活的細胞中都存在代謝反應，代謝反應對維持機體的生長、發育以及維護細胞的結構和功能至關重要[9]。根據結構和功能不同，將代謝物劃分為初生代謝物和次生代謝物。初生代謝物是植物產量和品質的化學基礎，是維持植物生命活動和生長發育所必需的物質。一般來說，初生代謝物的結構和豐度相對保守。次生代謝物雖不是生命活動和生長發育所必需的物質，但在植物遭遇病蟲害或逆境時，對維持機體內物質的動態平衡有重要意義。不同物種次生代謝物的結構和豐度具有較大差異[10]。

3.1 mGWAS解讀初生代謝物的遺傳機制

初生代謝產物又被稱為植物的營養物質，主要包括蛋白質、糖、脂肪、維生素、礦物質、水及其他各類微量活性功能成分。植物不同品種、組織及器官的營養成分也存在差異。在某些情況下，植物的營養物質是植物形態特征的標記物[11]。利用代謝組學，可以獲得不同品種、組織及器官的營養成分及含量信息，借助mGWAS分析，可以對這些代謝物的遺傳機制進行解析[12]。Chen等[13]選取502份水稻品種，利用Illumina HiSeq 2000平臺進行測序，通過高通量LC-MS/MS分析檢測到837個代謝產物，發現有587個代謝產物受遺傳調控，且代謝物之間有較強的相關性，如纈氨酸和苯丙氨酸代謝呈顯著正相關(P<0.05)，同時不同亞種間代謝物也有相關性；通過mGWAS分析，共檢測到1 489個顯著關聯位點，可注釋到參與氨基酸及其衍生物合成和運輸等相關的60個候選基因。為進一步驗證GWAS結果及候選基因功能，對10個代表性候選基因進行了功能驗證，發現了控制粒色和粒徑的潛在候選基因，為代謝物和表型關聯分析提供了有力證據。Angelovici等[14]檢測了313份擬南芥籽粒中18 種游離氨基酸的絕對含量，利用氨基酸含量之間的比值為衍生性狀進行mGWAS分析，確定了12種相互關聯氨基酸的代謝網絡，并發掘出一個與組氨酸相關的候選基因CAT4，并利用RNAi對該基因進行了功能驗證。Deng等[15]將513份玉米自交系在云南和重慶兩種環境種植，分別測定了籽粒中17種氨基酸的含量，通過mGWAS在兩種環境中分別檢測出247個和281個關聯位點，這些位點的平均貢獻率分別為7.44% 和7.90%，意味著氨基酸的遺傳受有限基因座調控，并進一步解析了氨基酸的生物合成和分解代謝途徑。Chen等[16]利用GWAS分析普通小麥籽粒中20種游離氨基酸(free amino acids，FAAs)，共鑒定出328個關聯位點，不同FAAs的關聯位點數在8～41個，在這些關聯位點附近，共發現15個候選基因參與FAAs的生物合成，其中1個候選基因編碼色氨酸脫羧酶，參與色氨酸的合成。Zhou等[17]對3 991個玉米葉尖和葉基部的質量性狀進行分析，檢測了玉米不同組織及不同亞群中特異性代謝物，mGWAS結果表明，90%的關聯位點具有多重性，分布于不同染色體。Du等[18]對419份陸地棉品種進行深度測序，檢測了約366萬個SNP，對13個纖維相關性狀進行GWAS，發現有7 383個SNP與纖維性狀顯著相關，并且D染色體上的關聯位點數要多于A染色體，研究表明，在長期馴化和育種過程中，人們對纖維品質的選擇增加了優異等位基因出現的頻率。

3.2 mGWAS解讀次生代謝遺傳機制

次生代謝物對植物正常生長和發育是非必需的，如生物堿、類黃酮、萜類和苯丙酸等物質，但其在植物抵御生物和非生物脅迫中發揮著重要作用。此外，植物次生代謝物對制藥工業具有重要作用，如顛茄中提取的阿托品、罌粟中提取的嗎啡、金雞納樹中提取的奎寧等。除不同物種水平的代謝物多樣性外，植物次生代謝物的累積還表現出時空特異性[1,7]。Matsuda等[19]選取175份水稻材料，利用GWAS研究了水稻次生代謝物的遺傳基礎，89種次生代謝物共檢測出323個關聯位點，一些代謝物僅由少量主效位點控制，一些位點與多種次生代謝物密切相關。為解析番茄代謝組的遺傳機制，Zhu等[20]檢測了番茄果實中次生代謝物，研究表明，在馴化中對番茄味道的選擇是對番茄堿進行了負選擇，利用mGWAS技術發現，控制此性狀的關聯位點位于人類長期選擇的區域，其中10號染色體上檢測到一個新的基因簇，包含1個P450氧化還原酶基因、1個酰基轉移酶基因和8個糖基轉移酶基因。Fang等[7]對來自秈稻和粳稻兩個亞種的502份水稻材料進行分析，結果表明，多酚類物質在葉片中的累積量高于籽粒，而黃酮類化合物如苯丙素、糖基黃酮主要在籽粒中積累。Zhou等[17]對282份玉米自交系進行代謝組學分析發現，不同品種的苯并惡唑嗪酮類化合物含量差異顯著，葉尖和葉基中黃酮含量也存在差異，可能是由于葉尖需要更多的類黃酮來抵御生物和非生物脅迫；通過mGWAS發掘調控苯丙惡嗪和苯丙烷類物質的基因座，表明了次生代謝物遺傳調控的復雜性。Fernie等[21]對擬南芥中黃酮類化合物的靶向代謝組進行分析，從1 800種代謝物中鑒定出8種新的花青素，獲得2個糖基轉移酶基因，分別編碼類黃酮3-O-葡萄糖基轉移酶和花青素5-O-葡萄糖基轉移酶；除與花青素代謝有關的已知基因外，還發掘出一些功能不明或假定功能注釋的基因，這些基因可能與糖基轉移酶、酰基轉移酶、谷胱甘肽S-轉移酶、糖轉運蛋白等有關。將代謝組學和轉錄組學相結合，不僅提供了一種發掘調控代謝物基因的新方法，并進一步揭示了花青素和槲皮素衍生物的遺傳機制[21]。

4 mGWAS對植物生長發育調控和應激反應的解析

由于代謝物與植物表型的相關性較大，因此，代謝組學對研究植物生長發育過程尤為重要。全面闡明植物發育的生化和遺傳機制以及應激反應的遺傳基礎在很大程度上依賴于代謝組學在植物科學中系統、綜合的應用。代謝組學可以檢測植物不同發育階段和不同環境脅迫下的特征代謝標記物，篩選出的標記物可作為植物的代謝診斷物，育種家可以結合遺傳背景和環境變化來識別代謝標記物。

4.1 mGWAS對植物發育時空代謝譜的解析

功能基因組學提供了基因和蛋白的時空表達模式信息，代謝組學可以將豐富的代謝物數據添加到功能基因組數據中，以了解植物發育的整體情況，探索植物生長發育過程中代謝物的動態變化，為代謝物質遺傳機制的解析提供新見解。無論是單子葉水稻還是雙子葉擬南芥，在植物進化中代謝物的累積具有相似的特點[6,19]。Dong等[22]對水稻兩個亞種進行mGWAS分析發現，酚酰胺類化合物的豐度在發育過程中受時空調控，在不同組織中的累積也存在差異，由此表明，種子成熟和萌發過程中的代謝物以及編碼代謝物相關基因的表達均受時間和空間的影響。Strauch等[8]對擬南芥全基因組關聯分析發現，種子發育始于胚胎發生后的代謝活躍期，在此期間合成大量的儲備化合物。種子成熟與大多數糖、有機酸和氨基酸的顯著減少有關，這表明它們能有效地轉入貯藏庫。從貯藏積累到種子干燥轉變與代謝物的轉換有關，導致不同糖、有機酸、富氮氨基酸和莽草酸衍生代謝物累積。Zhu等[20]研究番茄種子氨基酸的代謝規律發現，氨基酸在整個種群中表現出高度的多樣性，糖表現出明顯的季節波動。Toubiana等[23]和Fait等[24]對番茄果皮代謝物分析發現，代謝物多態性主要受基因型影響，受環境或組織影響較小。植物發育的時空代謝特征可以作為潛在的生物標志物，從而捕捉植物遺傳發育的內在特征。目前，該方法已成功應用于水稻分蘗的研究，Dong等[22]對水稻分蘗發育過程中的代謝組學數據進行分析，發現其中21種代謝物捕獲了約83%的代謝反應，這些代謝物在植物發育過程發生明顯變化，它們可作為快速篩選與發育相關代謝譜的基礎。Tarpley等[25]為研究大豆葉片從營養生長到生殖生長階段代謝物的轉變，追蹤整個生育期的代謝譜，結果表明，山奈酚黃酮苷元、大豆苷元、染料木黃酮和香豆黃酮可以作為生長標記物，8種隨著特定發育階段和環境信號而變化的黃酮類山奈酚苷被確定為潛在的生長標記物。由于代謝物種類繁多，在植物的不同細胞、甚至亞細胞水平上均存在差異，因此，用于分辨植物代謝物的高分辨率技術越來越受到重視[26]。Rolda等[27]以3—9日齡幼苗為材料，分析種子、子葉、下胚軸和根系中代謝物的差異，結果表明，皂甙類化合物主要積累在種子中，生物堿主要積累于根系中，糖基化黃酮醇主要積累于子葉中，花青素主要積累于下胚軸中，85% 的代謝物都表現出器官積累特性。Fernando等[28]分析毛果海棠生物量及木材的化學成分發現，春芽物候、水分利用效率、碳氮同化以及木質纖維素也均存在代謝物的差異累積；還發現1個涉及RNA轉錄調控的核糖核酸外切酶基因(XRN4)在乙烯信號通路中發揮作用，同時參與脅迫應答，該基因可能影響氮代謝和葉片形態建成；纖維素合成酶基因(CesA1A，CesA2B和CesA1A)與木質素的形成密切相關。水稻種子的萌發活力是一個復雜的數量性狀，需要同化、儲存和使用非結構性碳水化合物來產生幼芽和幼葉，將全基因組關聯分析(GWAS)應用于形態和非結構性碳水化合物檢測，結果表明，萌發活力由微效多基因控制，與糖含量密切相關；進一步研究表明，己糖在源葉和分生組織中累積，與舌狀葉的形成相關，在控制葉片大小和葉片生長中發揮重要作用[29]。代謝和代謝物的變化是發育過程的一部分，也是對發育過程的響應，這些變化既受生命進程的影響，也受外部因素的影響。

4.2 mGWAS解析植物應激反應機制

植物在發育過程中經常遭遇生物或非生物脅迫，一旦植物受到脅迫刺激信號，脅迫應答基因被激活表達，就會產生特異的脅迫代謝產物，特別是一些次級代謝物以適應環境脅迫[19]。Ahmed等[30]研究表明，植物對干旱和鹽分脅迫的耐受性與代謝水平有關，對耐鹽野生大麥的轉錄組分析發現，次級代謝物含量與對照具有較大差異，如黃酮和酚類化合物的含量顯著增加。植物受到脅迫后，其代謝反應受物種、組織和脅迫類型等影響，為了適應脅迫，植物通過復雜的生化反應來緩解脅迫造成的損傷。因此，脅迫環境下鑒定的代謝物有助于解析植物防御機制，同時這些代謝物也是植物防御反應的重要標志物。目前越來越多脅迫耐受或敏感的代謝標志物被鑒定[31]。如Agarrwal等[32]發現16種脂肪酸(如不飽脂肪酸和亞油酸)和2種氨基酸(谷氨酰胺和苯丙氨酸)為抗癭蚊水稻品種的抗性標志物。Sana等[33]發現苯乙酮、葉黃素、脂肪酸、生物堿、谷胱甘肽、碳水化合物和脂質的生物合成途徑受脅迫影響，并發現Xa21、GAD、PAL、ICL1和谷胱甘肽-S-轉移酶基因的表達量發生變化。Parker等[34]通過代謝組學分析表明，大麥和紫假雀麥草感染米曲霉后，代謝模式發生變化，蘋果酸、多胺、奎寧酸和非聚合木質素前體物大量累積。Gunnaiah等[35]發現，小麥被鐮刀菌侵染后，苯丙素和酚類化合物含量增加。苯丙素是木質素的前體物質，參與根的細胞壁建成，增厚細胞壁有助于植物防御病原體感染，是植物抗逆機制的重要組成部分。Luo等[6]在磷素充足和缺磷的條件下，以6個低磷敏感品系和6個低磷抗性品系為材料，結合代謝譜和全基因組關聯分析，比較玉米葉片和根系中與磷素缺乏有關的代謝途徑和基因，發現類黃酮、黃酮苷、多酚、苯并萜類化合物等42種次級代謝產物與磷素脅迫反應密切相關。Xu等[36]利用兩個玉米自然群體進行全基因組關聯分析，在兩個不同氣候和土壤類型的試驗地點進行鑒定，共檢測出259個與低磷脅迫相關的候選基因，這些候選基因主要參與轉錄調控、活性氧清除、激素調節和細胞壁重塑等四個方面。Courtois等[37]利用來自熱帶的167份粳稻資源，對根系性狀進行關聯分析，共獲得261個相關基因，其中27個激酶表達量較高，包括多銅氧化酶、赤霉素雙加氧酶、谷胱甘肽-S轉移酶及伸長因子等。未來代謝組學將致力于更好地理解植物對生物和非生物脅迫的應激反應機制，從而提高植物的抗逆性，減少因脅迫造成的經濟損失。

5 基于mGWAS的多維分析在植物中的應用

將代謝組學和轉錄組學數據相結合，這種多個數據集相結合可以彌補單一數據類型缺少或者不可靠的缺點。目前，多維分析方法已越來越多地應用于作物代謝遺傳機制的研究。Hegeman等[3]基于主成分分析法(PCA)，可以最大限度地提高GWAS對表型的分析能力，類似的策略也可應用于代謝物分析，該方法有助于解析代謝物多樣性的遺傳基礎。Huang等[38]開發了一種高性價比的GWAS方法，可以對低豐度測序數據進行高效、準確、快速的基因型鑒定，也可對代謝途徑和缺失數據進行補充。他們利用大樣本對水稻低覆蓋測序數據從頭組裝，構建了一張精確的高密度基因型圖譜；結合mGWAS分析共檢測到32個與開花時間、10個與籽粒形成相關的關聯位點，該結果表明大樣本提高了GWAS的檢測精度。利用多位點(multi-locus)mGWAS分析普通小麥籽粒中20種FAA，共鑒定出328個關聯位點，在這些位點附近共發現15個候選基因參與FAAs的生物合成[16]。這種方法彌補了單位點(single-locus)忽略代謝標記物疊加效應的不足[11]。由此表明，多位點mGWAS分析是一種非常有應用價值的方法。

利用物種進化的線性關系研究物種之間的相似性和差異性，可以深入了解各物種復雜的代謝途徑，GWAS為解析植物性狀的遺傳調控機制提供了方法。由于近緣物種間代謝物的結構相同或相近，利用mGWAS跨物種識別候選基因和代謝途徑成為一種新的嘗試。利用mGWAS在小麥、玉米、水稻等作物間通過比較連鎖圖譜，挖掘目標代謝物的候選基因，研究表明，在玉米通過GWAS檢測到的關聯位點分辨率較高，但效應值較低[12,39]；而水稻中檢測到的關聯位點效應值較高，但分辨率較低[13,16]。Chen等[16]利用玉米和水稻高分辨率圖譜和高通量SNPs，對籽粒中代謝物和表型性狀進行全基因組關聯分析，分別獲得420和292個關聯位點，共檢測到123個位點在水稻和玉米中與同一代謝物相關，兩個物種之間共檢測到23個共同代謝特征，發現調控種子大小、粉碎習性和開花習性的基因座在兩種作物間有較好的同源性，一些候選基因也存在共線性關系。該研究為植物功能基因組學和代謝組學的相互結合，特別是復雜性狀的遺傳解析提供了有力的支持。多維分析有利于代謝組遺傳機制的深度解析，但是由于目前許多物種代謝組提供的信息有限，限制了該技術的應用。

6 展望

代謝組學是轉錄組學和蛋白質組學的下游，被認為是連接基因組和表型之間的橋梁。一個物種代謝組的實際大小無法同轉錄組或蛋白質組一樣，由已知的基因組信息通過中心法則進行推測，因此，代謝組學與基因組學相結合可以獲得更多有價值的信息。對代謝組學的深入研究極大地拓寬了人們對植物復雜代謝網絡的認識，以及對植物生長發育和脅迫應答機制的了解。代謝組學分析有助于通過代謝網絡了解基因型與代謝物間的關系。隨著基因組測序技術和生物信息學的應用，植物代謝組與功能基因組學相結合，已應用到許多領域，盡管目前還存在一些局限性，但它無疑是植物生理學和作物育種學的一個重要工具。基于來自不同組織或不同條件下代謝組數據的GWAS分析表明，許多關鍵基因對代謝物的積累具有重要作用，還發現不同物種間同源基因調控的代謝物具有相同或相似的化學結構。然而，整合多組學數據解析植物代謝組仍然具有挑戰性，因為每個獨立個體的代謝網絡都是錯綜復雜的。如何更高效地認識并區分結構相似但代謝途徑不同的代謝物以及它們的生物學功能？如何探索關聯代謝物或者衍生代謝物的代謝途徑？這些都是mGWAS需要重點關注的問題。今后，代謝組學平臺的改進為準確有效地鑒定盡可能多的代謝物(尤其次生代謝物)提供了可能，精確解釋這些數據，并與其他平臺快速集成，解析主要農作物代謝物的分子生化機制，深入了解作物在正常和脅迫條件下生長發育過程中的代謝途徑，為提高作物產量和品質服務。