基因組學在干眼研究中的應用進展

沈乎醒，高衛萍，韋慶波，徐 倩

0引言

干眼是一種淚膜失去穩定性，伴有眼表不適癥狀的常見疾病，全球發病率約為5%～50%，我國發病率為21%～68.3%[1]。干眼的眼表不適癥狀，如干澀、異物感、燒灼感、刺痛感等，治療困難，嚴重影響患者的工作和生活。2017年國際眼表和淚膜協會第二次會議(TFOS DEWS Ⅱ)強調干眼的主要發病機制是淚膜高滲和不穩定、眼表炎癥和損傷以及神經感覺異常，年齡、性別、用眼方式、滴眼液中的防腐劑和全身性藥物、隱形眼鏡、眼科手術和非手術治療都可能導致干眼[2]。未來干眼的研究需要進一步的流行病學調查以更好地確定風險因素，創造出毒性更小的藥物，設計出創傷更小的眼科手術，基因組學的發展為這些研究打開了新的局面。聚合酶鏈式反應(PCR)和免疫印跡實驗(Western blot)、基因組學等技術的廣泛運用，進一步明確了干眼患者眼表細胞因子和淚液成分的變化。宏基因組學、基因工程動物、基因芯片及基因轉染研究的開展，為深入研究干眼的發病機制，研發治療干眼的新藥提供了良好的條件。

1宏基因組學在干眼發病率研究中的運用

在已報告的干眼發病率調研中，超過40歲的患者約38%～68%有瞼板腺功能障礙(MGD)[2]。研究表明，眼表微生物群與MGD導致的干眼密切相關，但因為淚膜的抗菌特性和淚液的機械沖刷，只有零星的眼表區域被微生物定殖，細菌培養技術有限，無法準確檢測[3]。宏基因組學的技術可以分析復雜環境群落微生物，甚至包括不可培養的微生物[4]。

Li等[5]提取了35例40歲以上的干眼患者(其中25例診斷有MGD)球結膜多個部位拭子樣本中細菌的DNA，并用PCR技術擴增RNA，繼而采用QIIME軟件對細菌16SrRNA基因V3-V4可變區進行測序，分析結膜樣本中微生物群落OTU聚類及多樣性。不僅區分了易致干眼的細菌以及益于眼表健康的菌落，還發現假單胞菌、巴氏桿菌等才是MGD的關鍵致病菌，而金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌則與MGD的發病無明顯相關性。MGD導致的干眼與年齡也有關，研究指出老年小鼠MGD與人類MGD患者表現的眼表癥狀相似[6]。人與小鼠的基因有80%相同，Parfitt等[7]摘取3月齡和2歲共10只小鼠的瞼板腺等組織，采用高通量基因測序方法讀取組織中提取的DNA并制成了宏基因組文庫，對不同年齡小鼠的瞼板腺等組織進行差異基因表達分析，結果顯示有698個基因被鑒定為差異表達，確定了包括成纖維細胞生長因子(FGF)和Wnt在內的數條信號通路在瞼板腺隨著年齡發生功能障礙的過程中產生重要作用，為進一步研究MGD導致干眼的機制提供了基礎。IL-2受體α鏈(CD25)是IL-2的結合受體,CD25基因敲除(CD25KO)小鼠表現出干燥綜合征(Sj?gren綜合征)的多種特征，包括雙眼皮腺炎、眼瞼腺炎和角膜結膜炎等[8]。Zaheer等[9]比較了飼養在常規和無菌條件下的CD25KO小鼠，無菌飼養的CD25KO小鼠與常規的相比，結膜杯狀細胞密度降低，角膜屏障功能障礙明顯，CD4+T細胞浸潤增多。將野生型C57BL/6J小鼠糞便的微生物移植給無菌CD25KO小鼠，可逆轉無菌CD25KO小鼠的自發性干眼表型。研究表明，體內共生微生物的缺乏可加速淚腺炎癥發生、加重其嚴重程度，并產生了具有更強致病性的CD4+T細胞，共生微生物或其代謝產物具有保護外分泌腺的免疫調節特性。宏基因組學揭示了微生物在干眼發病原因和發病機制中的重要地位，為精確治療干眼提供了新的靶點。

2基因芯片在干眼炎癥機制研究中的運用

淚液中含有復雜的細胞因子成分，可調節多種細胞功能，也可作為干眼發生的眼表標志物和疾病康復的信號。由于淚液樣本微量，ELISA只能檢測樣本中復雜的細胞因子中的個別因子的濃度，想要得到淚液中各種細胞因子之間相互作用和整體變化的結果，需要大量檢測樣本，操作繁瑣，費時費力?；蛐酒?，又稱DNA微陣列，可以通過生物發光、化學發光檢測雜交探針的位置，與大量被測生物細胞或組織標記的核酸序列雜交后，實現基因信息的快速檢測[10]。基因芯片技術具有高通量、高靈敏度、高特異性的特點，非常適合于同時檢測微量淚液樣本中的多個細胞因子[11]。

Li等[12]采用細胞因子基因芯片檢測干眼模型鼠淚液中炎癥因子、抗炎因子、生長因子以及其他細胞凋亡因子等，發現B7-2/Cd86、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、Fas配體、TNF-α和TIMP-1較正常水平升高?；蛐酒夹g也可用于分析不同疾病導致干眼的淚液成分的特異性變化，為預防繼發性干眼提供早期診斷和療效評估的實驗指標。例如曾孝宇[13]通過人干眼定量抗體基因芯片(QAH-DED-1)檢測糖尿病干眼患者的淚液樣本，發現干眼患者淚液中EGF、IL-1RA及MIP-1d較非干眼糖尿病患者的有明顯趨勢變化，這些細胞因子或許可以成為糖尿病性干眼早期診斷的標志物。Gad等[14]用多重細胞因子抗體基因芯片測定配戴硅水凝膠角膜軟性接觸者淚液中7種細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α的濃度，顯示有干眼眼部癥狀的配戴者促炎細胞因子IL-17A水平較高，證實了角膜軟性接觸鏡導致的干眼眼部癥狀與眼表炎癥有關。Zhang等[15]運用細胞因子基因芯片數據檢測鬼針草水提取物對干眼模型鼠淚液中細胞因子B7-2/Cd86、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、FasL、TNF-α和TIMP-1的作用，為進一步選擇合適的細胞因子進行Western blot、檢驗鬼針草的抗炎作用提供了便利。

3基因轉染在干眼新藥研究中的運用

在干眼流行病學調查中，根據癥狀報告得出的疾病總發病率在14.4%～24.4%，根據體征報告得出的則為1.3%～10.4%[2]，神經病理性疼痛在干眼發病機制中有重要作用，是導致干眼癥狀和體征分離的主要原因。干眼淚液分泌減少以及炎癥均可激活角膜傷害性感受器，導致疼痛不適癥狀[16]。角膜的傷害感受器包括機械神經感受器、多模態-嗅覺傳感器以及冷熱覺感受器[17]。Yang等[18]將不同濃度的角膜冷覺TRPM8受體激動劑cryosim-3(C3，1-二異丙基膦酰基壬烷)溶液用于穩定轉染人TRPM8 cDNA的中國倉鼠卵巢細胞，測試細胞內鈣離子動員曲線，從而篩選有效激動劑濃度，經過鼠感覺神經元鈣反應試驗后，最終選取合適的cryosim-3濃度(2mg/mL)溶液用于干眼患者眼表，證實cryosim-3溶液可緩解干眼患者眼表燒灼感等不適癥狀，為治療干眼提供了新型的藥物和研究方法。

眼部的基因治療具有局限性，角膜和結膜、上皮和淚膜以及如眨眼或淚膜間隙等生理機制限制了DNA有效地滲透到眼球?；钚苑肿优c納米載體的結合，使分子能與特定的眼球結構緊密地相互作用，克服解剖和生理障礙，延長DNA在靶組織中的停留時間[19]。MUC5AC是一種具有凝膠形成特性的糖蛋白，Contreras-Ruiz等[20]將含有加載了編碼修飾的MUC5AC蛋白的納米質粒的陽離子化明膠覆蓋在健康和實驗性干眼小鼠的角膜上，成功地在角膜和結膜上皮細胞轉染了MUC5AC蛋白，修正了干眼小鼠眼表組織MUC5AC的表達，使其眼表組織的結構和形態趨于正常，炎癥因子水平下降，CD4+T細胞浸潤減少，干眼癥狀明顯減輕[21]。將基因轉染技術和納米分子材料學技術相結合，更加有效地為研發治療干眼新藥物提供了新的技術。

4基因測序在干眼手術治療中的運用

越來越多的患者尋求眼部護理和整容手術，如長期配戴角膜鏡和使用含有防腐劑的滴眼液、多次眼表手術等都可能使角膜上皮損傷、角膜緣干細胞(LESCs)功能障礙或缺損，出現干眼。癥狀嚴重者可有眼瞼痙攣、劇烈疼痛，甚至失明[22]。1989/1994年先后報道了成功完成人自體LESCs移植和人同種異體LESCs移植重建角膜表面，治療眼表損傷和LESCs缺乏[23-24]，研究人員從1997年開始進行體外擴增的LESCs研究。明確角膜上皮的表型是成功獲得體外擴增LESCs的關鍵因素[25]。由于缺乏LESCs的特異性生物標志物和原位上皮細胞亞群的精確分子表征，這一生物工程領域的進展受到了實質性的阻礙。Bath[26]利用激光捕獲顯微解剖和RNA測序相結合的方法，對人類角膜上皮細胞的原位亞群進行分析，進行全局轉錄組分析，明確了原位角膜上皮亞群的綜合分子表征，獲得了適合LESCs的選擇性體外擴增的有效低氧濃度和培養基，為通過培養的角膜上皮移植治療角膜緣上皮干細胞缺乏提供了大量的數據。間充質干細胞(MSCs)被認為是值得進一步探索的可以限制組織破壞的修復細胞[27]。Lee等[28]將小鼠骨髓衍生間充質干細胞(mMSCs；1×105cells/20μL；BSS)注射到干眼模型鼠淚腺中，與注入PBS緩沖液的淚腺組織進行對比，結果顯示淚腺注射mMSCs后組織中CD4+細胞浸潤減少，IL-2和IFN-γ表達水平下降；瞼結膜的杯狀細胞的數量明顯增加、黏液的分泌量也有所增加；萎縮的淚腺結構在局部灌注mMSCs后也有部分恢復，表明MSCs可以通過抑制炎癥，促進組織修復來保護眼表。干細胞的培養和移植依賴在干眼領域的研究還有可以探索的廣泛內容，運用好基因組學的技術，可以促進干細胞在干眼領域運用的長足進步。

5基因工程動物在干眼動物造模研究中的運用

基因工程動物的發展為復雜性狀疾病的研究提供了理想的動物模型，可以在活體內分析單個候選基因的作用，將復雜的問題拆解開分析，分別對單一因素進行分析，為深入研究發病機制和基因治療創造了條件[29]。淚腺功能障礙使淚液分泌減少，引發干燥、導致炎癥反應是干眼重要的發病機制之一。

低氧誘導因子(HIF-1α)介導的細胞凋亡誘導配體(TRAIL)可調控炎癥因子和免疫細胞表達[30]。Ji等[31]將HIF-1α條件性基因敲除的C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠共同放置設定的干燥環境并皮下注射氫溴酸東莨菪堿(5mg/mL)誘導干眼，結果顯示HIF-1α基因敲除的小鼠淚腺腺泡細胞中CD45+細胞的浸潤顯著增強，TRAIL基因表達水平較野生型明顯降低，炎癥因子IL-1β、IL-17A蛋白表達水平顯著升高，誘導加速了腺泡細胞死亡。該研究為淚腺腺泡細胞衍生的TRAIL在炎癥性損傷中的調節功能提供了新的見解。淚膜的穩定性對干眼眼表的健康也很重要，淚液的脂質層可維持淚膜穩定性，磷脂轉移蛋白(PLTP)是人類淚液脂質層的正常成分。為了研究PLTP在淚膜穩定性中能否起到功能作用，Set?l?等[32]采用野生型C57BL/6小鼠和PLTP敲除的C57BL/6小鼠，均進行干眼誘導。PLTP敲除小鼠的角膜上皮損傷、上皮羧基熒光素通透性以及閉塞素裂解較野生型小鼠明顯加重。提示淚液中PLTP的存在對維持健康和功能正常的眼表是必不可少的?；蚬こ虅游锟梢詫⒏裳蹚碗s和混合的發病機制拆解開，深入研究發病機制，為進一步研究新型的治療藥物和手段提供方法。

6結語

新一代基因組學技術使臨床醫生和研究人員能夠從大規模研究群體中收集基因組數據量，結合新的信息學方法將多種數據與基因組數據進行集成后，更好地理解疾病機制和藥物反應[33]?！熬珳梳t學”這一概念被提出后，臨床上對基因組學的高通量測序技術需求越來越多。目前基因組學在干眼研究的主要側重于細胞因子基因的轉錄、翻譯和蛋白質-蛋白質相互作用的變化，腸道和眼表微環境菌落的多樣性宏基因測序、炎癥及凋亡細胞因子基因芯片檢測，這些先進技術的運用為臨床醫生提供了較多較完善的干眼發病原因和發病機制的研究結論，利于指導臨床醫生制定更精準的治療方案。此外，基因組學多重技術對治療干眼新藥和新治療技術研發等提供科學支撐，目前已有跨學科的研究，基因組學結合材料學、網絡藥理學等，不僅為眼表疾病，更為難治性、遺傳性眼底視網膜病變帶來治療的希望。在未來的研究中，更加側重于基因組學對干眼發病率、組織的修復和重建的作用，為尋找更加快速有效的診斷和治療方案以及疾病的預后提供新的思路。