基因編輯技術CRISPR-Cas系統與宮頸癌相關性的研究進展

滕元姬 陳志鴻

【關鍵詞】 CRISPR-Cas系統;基因編輯技術;宮頸癌

中圖分類號：R737.3?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.10.009

CRISPR是細菌和古生菌經過億萬年的長期進化而產生出的一種適應性免疫防御系統，它能夠通過crRNAs直接降解外源入侵DNA，從而保護自身結構的完整性和連續性。CRISPR-Cas基因編輯是一種由RNA引導的基因編輯技術，與鋅指核酶、轉錄因子核酶等傳統基因編輯技術相比，具有成本低、效益高、靈活性強、易于操作等優點[1]。宮頸癌是全球第四大常見女性惡性腫瘤，每年有超過50萬女性被確診。宮頸癌在我國發病率僅次于乳腺癌。近年來，其發病年齡呈年輕化的發展趨勢，有研究建議將宮頸癌的篩查年齡提前到35歲以前[2～3]。現通過CRISPR-Cas基因編輯技術圍繞宮頸癌的建模、早期篩查、耐藥性靶點治療等相關研究進展做一綜述。

1 CRISPR-Cas系統概況

1.1 CRISPR-Cas系統的發展

CRISPR-Cas最早是在1987年由日本研究人員在測定Escherichia coli堿性磷酸酶同工酶轉化基因IAP核苷酸序列時，在IAP 3端發現的以32個核苷酸為間隔，5組29個高度同源核苷酸序列排列而成的直接重復序列[4]。2002年Jansen等人通過silico分析技術進一步證實了這類重復DNA序列家族只存在于古生菌和細菌中。為了更好地定義這類直接重復的DNA序列，將它們正式命名為成簇規則間隔的短回文重復序列CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）[5]。2012年，研究人員通過引入RNA成功介導CRISPR-Cas9對目標基因組進行編輯，使CRISPR-Cas系統揭開了第三代基因編輯技術的序幕，并被Science評為十項重大科技成果之一[6]。近年來，CRISPR-Cas基因編輯技術越來越多地被用于醫藥生物科技、工業微生物領域等各個領域[7]。

1.2 CRISPR-Cas系統的作用機制

CRISPR系統根據其Cas蛋白基因含量不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型。其中CRISPR-Cas9系統是研究得相對成熟且使用最為廣泛的[8]。CRISPR-Cas9系統的免疫防御過程可分為適應、表達、干擾三個階段[9]。在適應階段，當細菌和古生菌識別到有噬菌體、病毒或外源性質粒入侵時，Cas1和Cas2通過原間隔區相鄰基因序列（PAM）的識別將入侵體的同源DNA短片段整合到CRISPR前導序列與第一個重復序列之間，完成對入侵體的適應過程[10]。在表達階段，含有入侵體DNA片段和PAM間隔區的CRISPR位點被轉錄產生一個新的CRISPR RNA前體（pre-crRNA），在CRISPR內切酶的作用下將pre-crRNA加工為成熟crRNA[11]。進而對入侵體的核酸進行切割。在I型系統中，crRNA將Cas蛋白復合物引導至與間隔區的入侵體互補的DNA靶點基因序列上，由CRISPR-Cas3負責對入侵的DNA進行切割[12]。在Ⅱ型系統中，攜帶crRNA的CRISPR-Cas9 在PAM26的識別下能直接針對入侵的DNA進行切割。細菌和古生菌便是通過此系統破壞入侵體DNA結構從而保存自身結構和系統的完整性。

1.3 CRISPR-Cas系統的廣泛應用

CRISPR近年來已經成為基因組編輯革命的代名詞。特別是RNA引導的核酸內切酶CRISPR-Cas9系統，其在基礎研究和基因編輯治療方法中的應用前景備受關注[13]。CRISPR-Cas系統是高效且易于編程、成本較低的核酸靶向工具，用途不僅局限于醫學科學研究和疾病診斷治療、藥物開發，也可用于細菌菌種分型、細菌耐藥性、自身免疫、自身靶向細胞調控等研究[14]，還可用于動植物的精確育種和工業微生物工程體系[15]。可以說，CRISPR-Cas系統已經被運用到人類生活的方方面面。

2 CRISPR-Cas系統在宮頸癌早期篩查診斷中的應用前景

目前，國內使用最廣泛的宮頸癌早期篩查主要手段包括宮頸液基細胞學檢查（TCT）和HPV-DNA檢測。但兩種方法都有其技術上的局限性，如TCT對樣本質量要求較高，取樣質量對檢測結果有較大影響，容易導致漏診發生[16]。HPV-DNA成品化試劑不能全面覆蓋所有HR-HPV檢測類型，而且檢測技術要求高，檢測成本高，不適于做全面推廣篩查[17]。CRISPR-Cas9/sgRNA系統在DNA檢測和分型方面具有巨大潛力，該系統對靶點識別的特異性高，對同源DNA的檢測和分型有很大幫助，因此，Cas9/sgRNA系統在DNA檢測中的應用日益受到廣泛關注[18]。例如，該系統已被用于美國和非洲的寨卡病毒檢測和分型[19]。另外，Cas9/sgRNA還被用來標記血液游離DNA中與疾病相關的突變基因，以便通過PCR技術更容易地檢測到它們[20]。同樣，若將CRISPR-Cas9/sgRNA系統引入宮頸癌早期篩查，設計E6/E7+CRISPR-Cas9引物探針對女性血液樣本進行PCR擴增技術檢測篩查，隨著PCR技術的日趨成熟，相信CRISPR-Cas基因編輯技術一定能成為宮頸癌早期篩查的一個新的、適宜推廣的、高效精準的檢測手段[21]。ZHANG等人在研究中開發了Cas9/sgRNA分型PCR檢測技術（ctPCR3.0），通過在qPCR反應中直接用Cas9/sgRNA對目標DNA進行切割，可以一步完成對目標基因的檢測和分型。他們通過檢測HPV各種基因類型，特別是臨床標本中的HPV類型，充分驗證了這項新技術的高可靠、特異性和靈敏性[22]。

3 CRISPR-Cas系統在構建宮頸癌模型中的應用

E6和E7病毒癌蛋白是HPV的早期啟動子。E6、E7在病毒復制過程中起著非常重要的作用，負責復制早期蛋白的表達，它可整合人宿主基底上皮細胞DNA中引起P53和PRB功能失調導致鱗狀上皮細胞分化周期紊亂[23]。E6和E7活性增加可以刺激細胞生長，抑制分化，導致染色體結構不穩定，從而導致腫瘤的發生[24]。因此，選擇性地剔除宿主細胞中的入侵性外源基因，特別是E6、E7基因，對預防和治療宮頸癌有重大意義。CHENG等人[25]成功構建hCas9-EGFP和E6-gRNA-RFP質粒，制備了攜帶有E6-gRNA和Cas9質粒的HPV16假型病毒，通過含有E6-gRNA和Cas9質粒的HPV-16假型病毒轉染SiHa細胞并成功表達E6-gRNA，E6-gRNA+CRISPR-Cas9轉染的SiHa細胞，其E6 mRNA和蛋白水平均明顯下調，增殖和遷移能力受到抑制，CRISPR-Cas9能夠有效地完成對靶基因E6的切割。結果表明利用HPV假型病毒介導的CRISPR/Cas9系統敲除E6基因具有消除HPV感染、抑制HPV相關腫瘤生長的潛在作用[26]。這些發現為預防和治療HPV感染的疾病，特別是與HPV相關的腫瘤提供了新的治療策略。

4 CRISPR-Cas系統于宮頸癌治療耐藥性的研究

腫瘤細胞對治療藥物產生耐藥性是癌癥治療面臨的主要問題，具有多重耐藥性是腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥的主要機制[27]。如何剔除腫瘤細胞的耐藥基因，使腫瘤細胞重新獲得對藥物的敏感性，可成為治療方案的一個突破口。CRISPR-Cas9系統在細菌耐藥性方面的研究應用已經是近年的研究熱點[14]。例如，李培思[28]研究團隊建立了一種單質粒介導靶向mcr-1基因的 CRISPR-Cas9系統，能有效并特異性消除黏菌素耐藥Escherichia coli中的mcr-1基因，恢復其對黏菌素的敏感性。可見，構建靶向耐藥基因的CRISPR-Cas9系統能從根源上解除耐藥基因，阻斷耐藥基因的復制傳代，重新恢復細胞對藥物的敏感性[29]。2015年，有學者運用 CRISPR-dCas9系統針對人體2萬多個基因設計70 290個sgRNA，構成人全基因組CRISPR-dCas9激活細胞文庫[30]。KARIMIAN運用CRISPR-Cas9系統特性切割肺癌患者的表皮生長因子受體（EGFR）突變基因，糾正其治療耐藥性[31]。類似的策略也運用在卵巢癌患者的ER或HER2突變中，SgRNA+CRISPR-Cas9系統被設計為針對ER或HER2突變外顯子中的特定序列來修復突變，破壞其耐藥功能結構域，使腫瘤細胞失去獲得性耐藥[32]。有研究者將CRISPR激活系統引入黑色素瘤細胞中，與促進黑色素瘤細胞抵抗BRAF抑制劑PLX-4720耐藥激活基因BCAR3共同作用于ERK信號通路下游和上游調控靶點參與耐藥機制調控[33]。同樣，宮頸癌主要是由HR-PHV病毒引起的，PHV癌蛋白E6、E7高度表達誘導正常細胞發生惡性病變[25]。CDDP是目前臨床上治療宮頸癌最有效的抗癌藥物，但其耐藥性的出現嚴重阻礙了宮頸癌的給藥治療[23]。有研究表明，E6/E7+CRISPR-Cas9與CDDP共同作用于腫瘤細胞，顯著抑制了細胞的體外生長和促進腫瘤細胞凋亡，這提示了HPVE6/E7+CRISPR-Cas9可以作為CDDP的增敏劑而發揮作用，兩者聯合治療可以明顯改善宮頸癌患者的預后，鼓勵進一步研究HPVE6/E7+CRISPR-Cas9與其他臨床化療藥物的相關性和協同作用，為宮頸癌的治療提供新的選擇[34]。

5 CRISPR-Cas系統面臨的挑戰與希望

CRISPR-Cas系統極大地促進了精準的基因組靶向編輯操作技術，并以各種方式廣泛應用于臨床癌癥治療，為癌癥治療開辟了新的途徑[35]。但不可否認的是CRISPR-Cas系統作為一種新型的基因編輯工具，其自身也存在一定的問題，如編輯細胞的適應性、編輯效率、傳遞方法和潛在的非靶向效應等[36]。如何降低操作過程中的脫靶率，成了更好利用該系統進行基因編輯的關鍵因素[37]。有研究提出，降低CRISPR-Cas9介導的脫靶風險可能的方法包括使用配對的Cas-nickaes（Cas尼克酶）、更短的Protspace互補區短鏈gRNA和高保真Cas核酸內切酶，以及修飾Cas9蛋白以改變PAM特性或增標靶DNA識別也可以用來減少脫靶效應，從而增強靶向特異性[38～39]。另外，科研工作者在醫學研究中必須謹慎使用CRISPR系統，避免類似“基因編輯嬰兒事件”再次發生[40]。但是，盡管存在一些挑戰，但CRISPR-Cas9技術作為一種強大的基因編輯技術，具有巨大的自身潛力和廣闊的運用前景[36]。相信隨著CRISPR-Cas9技術的不斷進步和創新，有望提高臨床疾病治療的安全性和有效性，給患者帶來希望。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-02-15 修回日期：2021-03-16）

（編輯：梁明佩）