MicroRNA在阿霉素心肌毒性中的作用機制*

胡 玲，周子默，周 馳，楊曉松

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室;3.湖北大學生科院省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是從真菌波賽鏈霉菌中分離出來的蒽環類抗生素，能嵌合到DNA堿基對中，干擾DNA、RNA的合成，對處于各個細胞周期中的細胞都有效。臨床上單獨或者和其它化療藥物合用來治療惡性腫瘤，如各種平滑肌肉瘤、淋巴瘤等[1]。然而DOX引起的毒副作用是其使用過程中的一個嚴重問題，這些副作用有時會導致比治療的疾病本身更嚴重的并發癥，尤其是存在劑量累積效應的心臟毒性。DOX在用藥初期出現的急性毒性是非特異性的，表現為各種心律失常，大多停藥后能自行緩解。長期用藥則會逐漸損害心功能，這種不可逆的慢性損傷為退行性心肌結構病變，最終演變成充血性心力衰竭。研究報道[2]DOX累積劑量大于550mg/m2會導致26%的患者發生DOX相關性心肌病。而且目前臨床上缺乏有效的藥物來緩解DOX所致的毒副作用，這些都使DOX在臨床應用上受到制約。當前關于DOX心肌毒副作用的潛在機制已有較多報道，但其精確調控環節還不明確，特別是涉及microRNA(miRNA)介導的表觀遺傳修飾調控。

miRNA作為一種天然的內源性非編碼單鏈RNA(約18～22nt)，通過與信使RNA的3’UTR非編碼區結合，引起靶基因的去乙酰化、失穩或翻譯抑制，從而抑制這些基因的表達，在不同的生理或病理過程中發揮關鍵作用。miRNA在心血管疾病發生發展過程中起調控作用是多種心血管疾病(包括藥物性心力衰竭)新的、強有力的治療靶點。另一方面，miRNA具備較高的物種保守性、容易檢測等特性，也被作為潛在的循環生物標志物用于幾種心臟疾病的診斷[3]。近期，DOX心臟毒性中有關miRNA表達調控也逐漸引起科研工作者的廣泛興趣。DOX心臟毒性中，miRNA在介導氧化應激、線粒體損傷、Ca2+動態平衡等過程中發揮關鍵調控作用，而通過靶向干預或藥物干預miRNA在DOX心臟毒性中的表達可明顯改善DOX心臟毒性，是預防或改善藥物誘導心臟毒性的一種新方法。因此，我們將就miRNA在DOX心肌毒性中的作用及潛在診斷標志物和藥物對miRNA的干預兩個方面展開討論。

1 miRNA在DOX心臟毒性中的作用

DOX心臟毒性機制比較復雜，涉及多種信號通路調控。DOX介導細胞內大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)的不斷累積，導致細胞內的氧化水平失衡，是DOX引起心臟毒性的關鍵過程，也是進一步引起DNA損傷、線粒體與能量代謝功能障礙、Ca2+紊亂等多種途徑介導的凋亡、壞死、焦亡、鐵死亡的重要誘因[4]。

1.1 miRNA在氧化應激途徑中的作用

Zhao等[5]識別了DOX誘導心臟毒性模型中大鼠心臟組織的18個差異表達miRNA，其中miR-140-5p表達明顯增加，其直接靶向Nrf2和Sirt2，通過影響HO-1、NQO1、GST、GCLM、Keap 1和FOXO3a的表達水平，加重心肌氧化應激。P66Shc是ROS代謝和細胞凋亡的調節因子。Liu等[6]報道p66Shc在給予促凋亡刺激后直接促進ROS的產生，敲除Shc1后，細胞會降低ROS并對凋亡產生抵抗。而miR-124可通過抑制p66Shc信號通路來減輕氧化應激損傷。另有研究報道[7]在DOX處理的小鼠模型中，miR-143的表達顯著上升，使用miR-143拮抗劑可下調DOX處理后AKT的磷酸化，并增加AKT的激活和蛋白激酶B (PKB)，減輕DOX治療后的氧化應激。

1.2 miRNA在細胞凋亡途徑中的作用

Wan等[8]使用公共微陣列數據集識別出DOX處理的心肌細胞中差異表達的miRNA和差異表達的基因，發現miR-15b-5p在DOX處理后的H9c2細胞中異常增多，骨形態發生蛋白受體-1A(Bmpr1a)顯著減少，Bmpr1a下游轉錄因子Gata4也下調。H9c2心肌細胞的凋亡可能經miR-15b-5p/bmpr1A信號轉導調控。同樣基于生物信息學數據挖掘，Pakravan等[9]發現在DOX治療后miR-130a表達顯著升高而且作用于過氧化物酶增殖物激活受體(PPARγ)，特異性的拮抗miR-130a可逆轉DOX誘導的PPARγ表達降低、細胞凋亡和炎癥反應。Tony等[10]則通過治療性沉默miR-208a來保存Gata4和Bcl-2，從而減少細胞凋亡，改善心功能。

此外研究報道[11]與miR-34a互補的antimiR (Ant34a)能夠降低DOX治療后大鼠心臟miR-34a水平，改善其心功能。Ant34a是通過解除心臟中miR-34a對靶點Sirt1的抑制，降低其靶蛋白p53、SMAD2/3和NF-κB的乙酰化水平，滅活下游通路，同時激活Bcl-2來降低DOX誘導的心臟凋亡。何夢穎等[12]通過對DOX處理后的心臟組織中miR-320a的檢測發現其水平顯著升高，且DOX對內皮細胞中miR-320a水平的影響更明顯。特異性的拮抗miR-320a增加了體外培養內皮細胞的增殖，減少凋亡的發生；并證實了血管內皮生長因子(VEGF-A)是miR-320a的靶點，miR-320a/VEGF-A信號通路調控血管穩態，緩解了DOX引起的損傷，減輕心功能惡化。

1.3 miRNA在Ca2+代謝紊亂中的作用

實驗[13]觀察到在DOX誘導的心肌損傷中miRNA378*反義鏈表達下調，上調miRNA378*可以緩解內質網應激(ERS)。此外發現網腔鈣結合蛋白(calumenin)可能是miRNA378*的靶點。calumenin能夠降低SERCA2活性和減少鈣調節蛋白(RyR2)在細胞中的釋放、攝取和儲存，維持鈣循環穩態。miRNA378*上調后calumenin水平隨之增高，葡萄糖調節蛋白GRP78減少，Bax水平減少，Bcl-2增高。miRNA378*是通過影響calumenin的表達來調節ERS和ERS介導的細胞凋亡的。miR-30是鈣/鈣調質信號的重要調節因子，Roca-Alonso等[14]通過DOX急性誘導體外培養的心肌細胞損傷、DOX誘導的慢性心力衰竭進行心肌miRNA譜分析，并與心肌梗死后重構心臟的miRNA譜進行比較，miR-30家族在三種模型中均下調。miR-30調控β-腎上腺素能通路，其中miR-30優先調控β1-和β2-腎上腺素受體(β1AR和β2AR)與Giα-2結合的直接抑制，且高miR-30水平對DOX毒性有保護作用。Gata6是與DOX相關的miR-30表達降低的中介，DOX是通過Gata6導致心肌細胞中miR-30的急性和持續降低。

1.4 miRNA在線粒體途徑中的作用

Wang等[15]觀察到在DOX誘導的細胞模型中，MiR-23a的顯著升高抑制了靶蛋白PGC-1α的表達，而抑制miR-23a可通過恢復PGC-1α和抑制p-Drp1依賴的線粒體分裂和凋亡減輕DOX誘導的線粒體功能障礙。另有研究表明[16]miR-181c存在于心臟線粒體中，其過表達通過調節線粒體基因表達影響線粒體功能并發現miR-181c靶向線粒體中的MT-COX1對心肌有明顯的保護作用。文獻[17]報道，DOX處理過的大鼠中miR-29b是miR-29家族唯一一個心肌表達下調的。特異性上調miR-29b抑制了DOX引起的Bcl-2水平增加，Bax表達和Caspase-3活性降低。miR-29b是直接負調控Bax的表達來抑制線粒體依賴性凋亡通路。

1.5 miRNA在自噬途徑中的作用

ACE2能減輕心臟負荷、降低外周阻力，顯著改善左室收縮功能。ACE2過度表達可抑制miR-30e，miR-30e模擬物處理可降低Beclin-1的表達和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值。ACE2通過保存miR-30e/beclin-1信號通路上的心肌細胞自噬而減輕DOX所致的心功能障礙[18]。另有研究[19]也發現DOX處理的小鼠心臟和H9c2細胞的自噬水平均升高，高表達miR-204通過抑制自噬發揮保護作用，而HMGB1可直接與Beclin-1和ATG5相互作用，并在炎癥過程中阻斷calpain介導的裂解，從而維持原自噬功能。miR-204能直接降低HMGB1的表達來預防DOX誘導的心肌細胞損傷。增加miR-204的表達可能是DOX誘導的心臟損傷患者的一種新的治療選擇。

1.6 其他新靶點

miRNA不僅在DOX引起的心臟損傷中參與上述途徑的調控，還介導其他靶點。過表達促肥厚型miR-212/132家族可改善心臟功能，減少DOX誘導的心臟凋亡和萎縮，并維持心肌細胞肌原纖維結構。基于轉錄組分析發現脂肪儲存誘導跨膜蛋白2(Fitm2)是miR-212/132一個新靶點和下游效應分子，miR-212/132可抑制Fitm2的作用。除了Fitm2，過表達miR-212/132也導致其他靶點Rbfox1、Sgk3和Foxo3下調，Rbfox1缺失加重了應激誘導的心肌細胞肥大。這些額外的靶點可能與DOX心臟毒性模型中觀察到的miR-212/132抗凋亡和抗萎縮作用有關。因此，這些額外的靶點可能成為限制DOX介導的不良心臟效應的治療切入點[20]。Sun等[21]則研究了大鼠心臟組織中核仁素的表達規律，發現在體內和體外給DOX均能顯著改變核仁素的表達，核仁素過表達可減輕心肌細胞來自DOX所致的損傷。此外在體內和體外核仁素上調了miRNA-21的表達，核仁素通過調節miRNA-21的表達參與了DOX所致心臟損傷和功能障礙。

1.7 miRNA作為DOX心臟毒性生物標志物

越來越多的腫瘤臨床醫生認識到早期識別藥物所致心衰風險對于腫瘤患者治愈及其預后顯得非常重要。目前，化療藥物所致心臟毒性評價主要基于左心室射血分數降低的心臟影像和循環系統肌鈣蛋白及腦利鈉肽等生物標志物的檢測，但是，左心室射血分數對于輕微心肌功能障礙的敏感性較差，而肌鈣蛋白及腦利鈉肽等的評價基本都是在心肌組織損傷后才出現異常[22]。因此，miRNA作為DOX早期心臟毒性生物標志物在體內外模型中被調查。在接受蒽環類藥物治療的兒童和青年患者中，血漿miR-29b和miR-499均升高，并且在急性心臟損傷患者中早期也高于緩慢升高或正常的肌鈣蛋白水平，這表明對miR-29b和miR-499的檢測可能作為蒽環類藥物誘導的急性心臟損傷的指標[23]。另一項針對接受蒽環類藥物化療的兒科患者的研究顯示，miR-499a-5p水平從蒽環類藥物方案開始到完成的變化與左心室射血分數下降正相關。這些發現可能提示miR-499a-5p可以作為接受蒽環類藥物的兒童患者左心室射血分數下降的生物標志物[24]。

2 藥物干預

miRNA通過多種途徑介導DOX心臟毒性作用且可能作為DOX心臟毒性生物標志物這些都表明miRNA在DOX心臟毒性中發揮重要調控作用。目前，許多研究者也發現在DOX心肌毒性模型中某些化學藥物及天然化合物作用于一些miRNA，可減緩DOX的心肌毒副作用。

2.1 化學藥物

異丙酚是一具有抗各種毒性損傷的多功能細胞保護麻醉劑，被證明可以改善多器官的缺血再灌注損傷，如心臟、大腦和腎臟。文獻報道[25]異丙酚在體外和體內靶向miR-181a/Bcl-2降低蒽環類抗癌藥誘導的心臟毒性具有心臟保護作用。右雷佐生是被FDA批準用以預防DOX引起的心臟損傷的保護藥物，研究[26]報道磷酸酶及緊張素同源物(PTEN)是miR-17-5p的靶基因，miR-17-5p降低了DOX處理后的心肌細胞中PTEN的水平。右雷佐生可能通過miR-17-5p/PTEN信號通路緩解DOX觸發的凋亡。這是第一個表明右雷佐生可能通過調節miRNA表達及其下游信號通路來保護心肌細胞免受DOX誘導損傷的報道。

2.2 天然化合物

天然產物薯蕷皂苷能提高大鼠和小鼠心肌活力，降低CK、LDH水平，改善組織病理學和心電圖改變，以保護DOX所致的心臟毒性并且薯蕷皂苷元通過調節體內外細胞內ROS、MDA、SOD、GSH和GSH-px水平，顯著抑制心肌氧化損傷。薯蕷皂苷還能夠降低miR-140-5p，激活Nrf2和Sirt2信號通路，從而影響HO-1、NQO1、Gst、GCLM、Keap1和FOXO3a的表達水平。因此，該天然產物未來可作為減輕DOX心臟毒性的新候選藥物開發，但是該天然產物抗DOX誘導的心肌損傷的深層機制還需要進一步研究[27]。另有中藥黃芪根莖中異黃酮類化合物鳶尾素(irigenin，IR)可通過減少心肌細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應，明顯減輕DOX心臟毒性。重要的是，DOX可顯著降低心臟組織和細胞中miR-425的水平，誘導受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)在體內和體外的過表達，而RIPK1是miR-425的直接靶點，鳶尾素可通過激活miR-425降低RIPK1的過表達顯著改善DOX誘導的心臟毒性，因此，鳶尾素可被認為是一種有前景的治療心臟損傷的藥物[28]。此外，丹參酮ⅡA可逆轉DOX處理后的miR-133下調進而抑制Caspase-9和相關凋亡效應物的激活，保護心臟[29]，這些都表明藥物對miRNA表達水平的影響或可成為一種新的治療DOX心肌毒性的手段。

3 結 論

綜上所述，我們從兩個方面介紹了miRNA在DOX心臟毒性中的作用，涉及miRNA相關信號通路調控以及作為生物標志物的重要作用。這些miRNA所涉及信號通路調控的機制研究將為臨床藥物治療DOX心臟毒性提供新的作用靶點，有益于擴大DOX在臨床腫瘤治療的應用范圍。但是，由于miRNA存在多個作用靶點，這為精確的靶向治療帶來新的挑戰。此外，miRNA作為心臟毒性早期診斷標志物具有獨特優勢，但目前有關循環系統miRNA表達水平評價與心臟毒性發展所處不同階段的相關性還缺乏數據，有待更多的臨床資料進行補充。

總之，小分子miRNA可通過多種途徑介導DOX心臟毒性作用，深入闡明miRNA的調控機制，對于緩解DOX所引起的心臟損傷藥物開發具有重要應用價值，為臨床癌癥患者DOX治療后提供心臟毒性的防治提供新的最優解決方案。