小鼠大腦皮質星形膠質細胞的培養、鑒定及其TRPC1-7 mRNA的表達

劉陽生

(咸寧市第一人民醫院神經內科，湖北 咸寧 437000)

中樞神經系統中，星形膠質細胞約占大腦總體積50%[1]，它為神經元提供能量與營養支持，調節突觸活性，還可以調節神經元內外離子、水以及神經遞質的平衡，影響神經元的電活動。星形膠質細胞的這些特點決定其在缺血性腦損傷、神經細胞再生和神經退行性疾病中均發揮著重要作用[2]。高純度星形膠質細胞的獲得是體外研究其功能和機制的基礎。星形膠質細胞原代培養過程中，易混雜多種細胞成分如成纖維細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞，因此，建立一種穩定有效的星形膠質細胞培養純化方法是體外研究的前提，為體外研究其功能和機制打下基礎。

瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)是重要的Ca2+通道，廣泛分布于從酵母到人類的各種生物體，通過改變細胞內游離鈣的濃度而發揮重要作用，有研究表明其與神經系統疾病相關[3]。哺乳動物TRP超家族可分為TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPP、TRPV和TRPN 7個家族，在體內分布廣泛，TRPC離子通道是位于細胞膜上的一類非選擇性陽離子通道，迄今，已在哺乳動物中發現7種TRPC蛋白：TRPC1、C2、C3、C4、C5、C6和C7，其中TRPC2為一種假基因編碼故在人體內缺失[4]。鈣庫操縱性鈣內流(SOCE)，即細胞內質網鈣庫耗竭，從而引發胞外Ca2+流入細胞內質網的這一過程，SOCE鈣通道的開放或關閉，調節細胞外Ca2+內流。一般認為，SOCE通道有賴于TRPC和Orai(calcium-release-activated-calcium channel protein)的參與[5]。眾所周之，星形膠質細胞為非興奮性細胞，且SOCE在非興奮性細胞的鈣信號中很重要[6]，TRPC通道在培養星形膠質細胞中都有表達[7]，因此，TRPC通道在星形膠質細胞中作為常見信號傳遞方式之一，胞內Ca2+水平變化與細胞生長、運動、周期、分泌、興奮、代謝、轉錄、細胞分化及凋亡等相關。TRPC通道的過表達、缺失和活化都對胞質Ca2+水平產生影響，導致鈣穩態失調，繼而對細胞功能產生影響。近年來，一些疾病被發現與TRPC通道的異常有關，因此，TRPC通道有望成為藥物治療的靶點[8]。本研究觀察體外培養星形膠質細胞TRPC1-7 mRNA的表達，為體外研究星形膠質細胞TRPC通道與神經系統疾病的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

1～3d的乳鼠40只，體質量2～3g，C57BL/6購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。實驗過程按實驗動物使用3R原則給予人道關懷，并通過倫理審查。

1.1.2 主要設備及試劑

CO2細胞培養箱、倒置顯微鏡FV500、FLUOVIEW共聚焦顯微鏡、實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀、空氣恒溫搖床、DMEM/F12培養基、D-hanks、PBS、TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、胰蛋白酶、多聚賴氨酸、兔抗GFAP多克隆抗體、羊抗兔IgG。

1.2 方法

1.2.1 大腦皮質星形膠質細胞原代培養

選取出生3d以內的乳鼠備用。取腦前為減少腦部血供用冰包埋4min，再用75%酒精消毒，用眼科剪剪開皮膚，剔除覆蓋于大腦上半部分的顱骨并取腦置于4℃ D-Hanks中。大腦經冰的D-Hanks漂洗后，放置于消毒過的濾紙上吸除多余液體，用眼科彎鑷摘除大腦半球，仔細剝離海馬、腦膜和血管等纖維成分。移入EP管內，用眼科剪充分剪碎，加入1mL 0.25%胰酶，置于培養箱37℃消化15min，每5min震蕩一次，用混有10%FBS的DMEM-F12終止消化，用吸管反復輕輕吹打，混勻至無明顯組織塊，吸取液體過200目篩網后1 000rpm離心5min，棄上清液，加入混有15%FBS的DMEM-F12重懸，接種于預先用多聚賴氨酸包被的培養瓶中，于37℃、5%CO2培養箱孵育差速貼壁培養，于30min、1h分別取出并輕輕翻轉培養瓶，吸出上清液以除去貼壁的成纖維細胞，將細胞懸液移至新的培養瓶中，24h后全量換液，以后3d換液一次。9d后待細胞生長分層，將培養瓶放入37℃搖床260rpm搖晃18h，棄除小膠質細胞和少突膠質細胞，溫D-Hanks漂洗細胞，用0.25%胰酶消化、傳代，減半接種，待37℃培養箱培養3～5d鋪滿瓶底，消化、傳代，一半細胞接種繼續培養，其余細胞接種于蓋玻片，免疫熒光法鑒定星形膠質細胞。

1.2.2 大腦皮質星形膠質細胞的免疫熒光鑒定

GFAP是星形膠質細胞所特有的骨架蛋白，可作為成熟星形膠質細胞的標志物[9]。采用免疫熒光染色對星形膠質細胞進行鑒定。步驟如下：星形膠質細胞接種于蓋玻片上，24h后經PBS漂洗，置于4%多聚甲醛中浸泡固定30min；細胞標本用PBS漂洗3次，10min/次；0.1%Triton滴于細胞上破膜5min；PBS漂洗3次，10min/次；將10%的羊血清滴于細胞標本上封閉30min；3%BSA稀釋一抗，配制成兔抗GFAP(1∶500)工作濃度，一抗滴覆于細胞標本上，4℃孵育過夜；PBS漂洗蓋玻片3次，10min/次；羊抗兔CY3(1∶2000)二抗避光孵育2h；二抗孵育后PBS漂洗3次，10min/次；將蓋玻片倒扣于處理過的載玻片上，甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下20倍觀察拍照。

1.2.3 逆轉錄RT-PCR

根據GenBank小鼠TRPC1-7序列進行引物設計：TRPC1上游5′-CTCAAAGTGGTGGCTCACAACAAG-3′下游5′-CATAGAGCTGAGTCAGTCCAATCG-3′；TRPC2上游5′-GGCTGTCAACTACAACCAGAAACAG-3′下游5′-AGCTGGCAGAATATATGCCAGTCG-3′；TRPC3上游5′-GGACTGTCTGAAGTGACTTCTGTT-3′，下游5′-CTCGAGTGAGACTGTGTGAAGAGG-3′；TRPC4上游5′-GTGGAGTGGATGATATTACCGTGG-3′，下游5′-TCAGGATGTCCAGAAGCATCCTTC-3′；TRPC5上游5′-TCCATGATTGGTGGAACCTGATGG-3′，下游5′-AGCATATTCAGCAGCACTACCAGG-3′；TRPC6上游5′-CCTACTGATCCTCAGATCATCTCT-3′，下游5′-CTCTGCATCTTCTTGGAAGCCTTG-3′；TRPC7上游5′-GACGGAGATGCTCATCATGAAGTG-3′，下游5′-CGGTAGTAGGAGTACAGGTTGAAC-3′PCR反應體系如下:cDNA 1μL，上游引物和下游引物各1μL，2×Mix 6.3μL，超純水4.2μL，總體系12.5μL。PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，退火30s，退火溫度：TRPC1 64.6℃，TRPC2 64.2℃，TRPC3 64.2℃，TRPC4 65.7℃，TRPC5 65.9℃，TRPC6 64.2℃，TRPC7 65.2℃，72℃延伸1min，40個循環后，72℃延伸5min。最后進行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結 果

2.1 星形膠質細胞的免疫熒光鑒定

體外培養的星形膠質細胞中，GFAP陽性的細胞可達總細胞數的95%，星形膠質細胞標志物GFAP細胞胞質為綠光標記，DAPI細胞胞核為藍光標記，見圖1(封三)。

2.2 星形膠質細胞TRPC1-7 mRNA的表達

RT-PCR產物證實小鼠星形膠質細胞上有TRPC1-7 mRNA的表達，見圖2。

圖2 星形膠質細胞TRPC1-7 mRNA的表達

3 討 論

星形膠質細胞的純化是進行其功能研究的基礎。本實驗選取出生3d以內的乳鼠，其腦組織分離細胞懸液中星形膠質細胞含量較多，且新生鼠腦膜較易剝離[10]，腦膜和血管等纖維成分對細胞的污染會降低，有利于星形膠質細胞的生長。

原代培養的星形膠質細胞貼壁相對較緩慢，因此，培養瓶預先用低濃度的多聚賴氨酸預包被，發現3～5h后絕大多數細胞貼壁良好。在細胞培養中，加入15%胎牛血清和DF12培養液重懸，未使用任何其它添加物，星形膠質細胞長勢良好。

組織消化時要選擇合適的消化時間，避免消化過度從而對細胞造成較大的損傷。傳代時胰酶的使用濃度0.25%較適宜，且消化時要密切觀察細胞的狀態，及時終止消化，傳代時減半接種。

原代分離的細胞懸液中，有神經膠質細胞、神經元、成纖維細胞等。本實驗通過選擇日齡合適的乳鼠，多次消化傳代、減半接種以及純化時借助37℃搖床機械振蕩，獲得了較純的星形膠質細胞。本實驗選取適齡乳鼠、分離組織時仔細剝離腦膜和血管等纖維成分、使用差速貼壁技術，來減少成纖維細胞的污染。至于培養物中的神經元，沒有特定的培養液在體外難以存活。少突膠質細胞在原代培養時位于星形膠質細胞層上，可借助恒溫搖床機械振蕩、多次傳代去除。

TRPC每四個家族蛋白可形成同源或異源四聚體，四聚體組成非選擇性陽離子通道，鈣離子經此通道進入細胞內，在神經系統，TRPCs參與神經干細胞增殖分化、神經元保護、軸突生長及導向、突觸形成等一系列神經生理功能，是當前研究的熱點之一。如何通過干預腦內TRPC治療神經系統疾病，從而發掘新型治療神經系統疾病的藥物成為研究的熱點[11]。有研究[7]報道TRPC通道(TRPC1-6)在培養星形膠質細胞中都有表達，本實驗也觀察到培養的大鼠星形膠質細胞上存在TRPC通道，有TRPC1-7 mRNA的表達。

在神經系統，TRPCs與多種神經系統疾病的發病相關[12]，因此，利用星形膠質細胞體外培養進行TRPC表達研究越來越受到重視。培養較純的、穩定的星形膠質細胞是在體外研究TRPC通道的前提條件，對闡明和研究其在神經系統疾病中的作用以及為發掘新型治療神經系統疾病的藥物或干預措施奠定理論基礎。