人工合成肽GH12在齲病防治中的研究進展

王丹妮綜述趙月萍審校

暨南大學口腔醫學院，廣東廣州510000

瑞典科學家BOMAN等在1972年發現的一種抑制細菌增殖的肽，這種肽在1981年被正式命名為抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)。抗菌肽是一類短的帶正電荷的生物活性分子，廣泛分布于人類的唾液、上皮和中性粒細胞中，具有廣泛的抗菌活性。迄今為止，有許多學者已經研究了許多天然抗菌肽對齲病的致齲細菌的作用，包括α防御素、β防御素、凱薩林菌素和人乳鐵蛋白等[1-2]。但由于天然抗菌肽存在毒性、溶血性、成本高、不易獲得等缺點，近年來研究者們開始設計合成肽，它們比現有的AMPs更短，細胞毒性更小，對致齲細菌更有效。

1 齲病病因及防治現狀

齲病是一種牙體硬組織發生慢性進行性破壞的口腔疾病，而細菌是公認的齲病病因之一，其所形成的牙菌斑生物膜是齲病發生的始動因子。盡管取得了顯著的進步技術和口腔保健意識的提高，齲齒患病率仍在快速地增長[3]。口腔菌群復雜，但研究表明[4-5]，在早期生物膜群落中超過60%是鏈球菌，且鏈球菌中的變形鏈球菌是目前公認的主要的致齲菌和病原體。對于早期釉質齲損，治療方案通常是藥物治療和充填治療，氟化物通常被添加到水和牙膏中來防齲和阻止早期齲損的進一步發展。氟化物通過抑制脫礦和增強晶體表面的再礦化來防齲，對于合適使用濃度方面仍然有爭議，使用較高氟化物的濃度可導致一定的毒副作用，比如氟斑牙、氟骨癥[6-8]。氯己定是一種陽離子廣譜抑菌劑，能有效抑制變形鏈球菌的數量及活性[9-10]，通常被制成漱口水使用來防治齲病，但是有使牙齒、黏膜著色、齦上結石形成增加、味覺暫時喪失等副作用。而對于形成齲洞的主要是通過充填治療，去除腐質后進行完善的充填可以很好的緩解齲病，如若腐質未去盡造成的細菌殘留可引起繼發齲壞，造成治療的失敗。目前，抑制致齲性口腔鏈球菌的生長仍有望在有限的時間內用作齲齒控制的輔助療法，特別是對高齲齒風險或齲齒活躍的個體。

2 抗菌肽的分類及與合成抗菌肽GH12

天然抗菌肽具有多效功能，它們不僅殺微生滅物，還參與調控宿主的生理功能，比如參與炎癥反應、傷口愈合等。它們的活性包括有趨化功能、細胞因子產生、組胺釋放、脂多糖結合和其他免疫調節活性，這些活性共同導致適應性免疫反應的激活[11]。抗菌肽按照來源分類可分為昆蟲來源肽、兩棲動物來源肽、哺乳動物來源肽、植物來源肽、細菌來源肽。按照結構分類主要分包括α螺旋、β折疊、環形和伸展性結構四類[12]。與口腔疾病關系密切的幾種抗菌肽主要有防御素、凱瑟林菌素及富組蛋白。

2.1 防御素最早在人類中性粒細胞中發現，是從參與宿主防御的肥大細胞和組織中分離出來的1 845個氨基酸長的陽離子分子。人防御素被分類為α-防御素(HNP)、β-防御素(HBD)。α-防御素被進一步細分為六種類型，其中HNP-1抗菌活性最強，對變異鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌有抗菌活性，尤其是變異鏈球菌對HNP-1最為敏感。β-防御素主要在各種組織和器官，比如牙齦、皮膚、胃腸道、呼吸道及腎臟的上皮細胞中表達。HBD-2與HBD-3均能殺滅包括變異鏈球菌在內的多種口腔鏈球菌，且HBD-3對致齲菌的抗菌效果最強[13]。

2.2 凱瑟林菌素(Cathelicidins)最初是從豬白細胞中分離出來的，它們是具有高度保守的N-末端結構域和C-末端抗菌結構域的前體蛋白，廣泛存在于哺乳動物體內，表現出廣泛的抗菌活性[14-15]。

2.3 富組蛋白(Histatins)由健康成人的腮腺和下頜下腺唾液管細胞合成，三個主要成員是His-1，His-3和His-5。它能夠抑制口腔念珠菌的生長，參與唾液中金屬離子的鍵合，口腔止血的調節、參與牙釉質膜的形成[13]。

2.4 合成抗菌肽GH12使用天然產生的抗菌肽作為治療劑有一些需要克服的局限性[16]，它們可能存在毒性、免疫原性、耐藥性、溶血活性和其他副作用[17-18]。為了獲得更強的生物效應并克服天然肽的缺點，人工合成肽是通過將兩種或更多種具有不同生物功能的不同肽的序列進行組合而設計，通過人為的控制其特性可以更廣泛的在口腔疾病方面應用[19]。有學者設計合成了只含有12個氨基酸的具有兩親性的α-螺旋抗菌肽GH12(GLLWLHLHLLH-NH2)[20]，在GH12序列的疏水側起點和親水側終點之間的界面處放置了一個色氨酸殘基，這種設計能夠穩定螺旋結構并提高抗微生物活性[21]，由于其穩定性更好、生產成本更低，未來可能廣泛用于齲病治療。

3 人工合成肽GH12對主要致齲菌的殺滅效果

3.1 體外研究效果TU等[20]首次對GH12對口腔鏈球菌的抗菌和作用機制進行了研究，發現GH12能有效抑制口腔鏈球菌，尤其對變形鏈球菌、遠緣鏈球菌和唾液鏈球菌的抑制效果更為明顯。GH12對口腔鏈球菌的MIC值為6.7～32.0μg/mL，MBC值為8.0～64.0μg/mL。GH12同其他α-螺旋抗菌肽一樣，在到達細胞膜后，分子的親水面被帶負電荷的磷脂頭基團吸引，而疏水面插入雙層[22]，在膜表面產生孔和破裂。盡管GH12具有上述防齲潛力，但它們對牙菌斑和齲齒的作用機制仍有待闡明。由于其大多數抗微生物研究數據是在口腔鏈球菌的浮游培養物中進行的，而關于它們的生物膜對應物的可用數據有限[23]。研究表明，與浮游狀態的細菌相比，生物膜與齲病的關聯性更強[24]。絕大多數研究表明，以浮游菌為基礎的藥物研究結果并不適用于生物膜內的細菌[25-26]。WANG等[27]從3種短抗菌肽中篩選出了二級結構最穩定、抗菌活性最強的肽GH12，研究了其對八種主要浮游致齲細菌的抗菌活性，并研究了其對單一變異鏈球菌生物膜的影響，發現GH12在低濃度下通過抑制變異鏈球菌的生長來抑制變異鏈球菌生物膜的形成。隨后JIANG等[28]研究了GH12對致齲多菌種(變異鏈球菌、血鏈球菌和戈登鏈球菌)生物膜的影響，發現不同濃度的GH12對生物膜中三種菌種的比例隨時間變化也有一定的影響，4 mg/L和8 mg/L的GH12對變形鏈球菌有明顯的抑制作用，但對血鏈球菌和戈登鏈球菌卻基本沒有影響。有學者指出，一種生物的代謝產物很可能對同一生物膜中種群間產生影響，而GH12通過降低生物膜中變形鏈球菌的胞外多糖的合成和乳酸生產及促進血鏈球菌和戈登氏球菌中過氧化氫的產生兩部分機制來改變多菌種生物膜的組成[29]。GH12顯著上調過氧化氫產生相關的表達基因spxB，促進血鏈球菌和戈登氏球菌中過氧化氫的產生，提高它們的生態優勢。但該研究并未對變異鏈球菌產酸相關的毒力因子進行探究，而變異鏈球菌產酸、耐酸、合成外多糖和形成生物膜的能力主要跟變異鏈球菌的毒力因子有關[30-31]，并且變異鏈球菌的致齲潛能不是由幾個毒力基因獨立表達的結果，而是一系列協同調節事件的結果[32]。隨后WANG等[33]第一次系統地研究AMPs對變異鏈球菌毒力和調節系統的影響，以亞MIC水平測定了GH12處理的變異鏈球菌的各種毒力基因(ldh、atpD、gtfB、gtfC、gtfD)和TCSTS基因(vicR、DAiR、comD、comE)的表達譜，發現被亞MIC水平GH12處理的變異鏈球菌的各種毒力基因幾乎均顯著下調，滅活特定調節系統，乳酸生成和乳酸脫氫酶(LDH)活性降低，導致產酸性、耐酸能力降低，胞外多糖合成減少和生物膜形成能力降低[33]。盡管如此，這些研究都是基于體外的研究。

3.2 體內研究效果為了進一步了解體內的防齲效果，WANG等[34]采用了大鼠模型來測試局部應用GH12是否能抑制體內齲齒的發生率和嚴重程度，其結果表明GH12可降低大鼠不同嚴重程度的齲病發生率和相應的變形鏈球菌種群，且局部使用8 mg/L GH12的效果明顯優于250 ppm氟化物。由于GH12對變異鏈球菌生物膜的生物量和致齲特性的聯合抑制作用，使體內變異鏈球菌的種群數量減少，殘留的變異鏈球菌生物膜酸性較弱且致密，從而抑制了齲的發生和發展。AMPs在體外和體內對復雜多種生物膜的功效仍有待進一步研究，盡管研究者用了牙菌斑衍生的多種生物膜和大鼠齲齒模型來模擬牙菌斑和實際治療應用，但它不能完全代表的影響人類口腔中的實際環境，因此應該進行進一步的研究。為了模擬更為復雜、真實的口腔生物膜環境，JIANG等[35]選取了健康人體牙菌斑生物膜來研究，與之前實驗研究結果有所不同，之前的研究表明8 mg/L的GH12能夠抑制預制的變異鏈球菌生物膜。然而在這項研究中，8 mg/L的GH12對牙菌斑來源的多種生物不足以顯示出抑制作用，而需要64 mg/L才顯示出最有效的抑制作用。這可能由于牙菌斑對抗菌劑具有更強的耐藥性，這也說明了單獨使用變異鏈球菌生物膜模型可能還不足以說明GH12的體外防齲效果。

4 展望

GH12作為一種人工合成的短肽具有良好的抗菌活性，未來可能成為抗生素及氟化物的替代產品，被制成漱口水或者牙膏制劑用于齲病的防治。目前的研究大多還處于體外階段，為了更深入的了解可能還需要模擬更真實的口腔微生物環境和更多的體內實驗。在口腔內復雜環境下對菌斑生物膜的殺滅效果未來仍需要大量的臨床實驗來探討。而且作為漱口水及牙膏添加劑，使用頻率高、在口腔內停留時間短，要在這么短的停留時間達到預期效果還需尋找出更為精確的合適使用濃度，既要能發揮最好的療效，長期使用又不至于造成口腔內微生物菌群的失調和微生態的失衡。