水溶性糖基銥配合物的合成、表征及成像分析

穆相君 馮青月 李梅金 易長青 付鳳富

(1福州大學化學學院，食品安全與生物分析教育部重點實驗室，福建省食品安全分析與檢測技術重點實驗室，福州 350116)

(2福州大學，能源與光催化國家重點實驗室，福州 350116)

(3中山大學生物醫學工程學院，廣東省傳感技術與生物醫學儀器重點實驗室，深圳 518107)

0 引言

近年來，具有d6電子結構的金屬銥配合物由于其相對較長的激發態壽命、較高的發光量子產率以及極好的發光顏色可調控性而被廣泛應用于光催化[1-2]、分子傳感[3-4]、有機發光二極管材料[5-6]、細胞成像[7]以及光動力治療[8-12]等領域。特別是在細胞成像方面，與傳統熒光有機小分子相比，銥配合物具有較高的量子產率、較長的發光壽命、較大的斯托克斯位移和可調控的發射波長，從而降低了細胞自身熒光帶來的干擾，因此受到了越來越多的關注。隨著生物醫學研究與應用發展的需要，這些材料近年來也被開發成為新型的生物醫學影像材料、染色劑等。

細胞成像技術的發展對研究生物體的各項生理功能、疾病的發展機理和某些疾病的早期診斷具有重要的意義。開發一種細胞毒性低、發光效果好的細胞成像探針也成了一個熱門的研究方向。然而金屬銥配合物的水溶性普遍不好，使得其在生物研究方面的應用受到很大的限制。如何提高金屬銥發光材料的水溶性，成為這類材料在生物醫學上研究應用突破的關鍵點之一。目前常用的方法是通過在配體上修飾特定基團，使這類配合物的一些物理或化學性質發生改變，進而拓展這類發光材料在更多領域的應用。如在多吡啶骨架上修飾糖基可以達到降低毒性和提高水溶性的目的，同時使細胞或組織上鍵合糖基的分子成為標靶[13-14]。我們通過在聯吡啶配體中引入多羥基的糖基合成了3種水溶性銥配合物(圖1)，并對其進行了表征，進而研究其光物理性質及其在細胞成像中的應用。本研究對拓展功能金屬配合物在生物分析領域中的應用有重要意義。

圖1 水溶性金屬銥配合物的化學結構Fig.1 Chemical structure of water-soluble iridium complexes

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

所用儀器有ThermoFisherEvolution220紫外可見分光光度計、EdinburghFS5熒光光譜儀、FLS920穩態瞬態熒光光譜儀、BRUKERDPX300核磁共振譜儀、INNIGANMAT95型質譜儀和CARLOERBA1106型元素分析儀。

重鉻酸鉀、濃硫酸、硼氫化鈉、乙二醇乙醚、碳酸鈉、甲醇鈉、氫溴酸等均為分析純。有機溶劑均購自國藥試劑有限公司。2，3-二氨基萘(99%)、1-苯基-1，2-丙二酮(98%)、2-(4-甲基苯基)吡啶購自梯希愛公司。1-硫代-β-D-葡萄糖四乙酸酯、無水氯化銥、2-(2，4-二氟苯基)吡啶(dfppy)購自Alfa Aesar。4，4′-二甲基-2，2′-聯吡啶和2，2′-聯吡啶購于百靈威化學試劑有限公司。

4，4′-二溴甲基-2，2′-聯吡啶的合成按照文獻[15]進行。4，4′-二(1-硫代-β-D-葡萄糖甲基)-2，2′-聯吡啶(bpy-sugar)[16]、4-(2′-吡啶基)苯甲酸(tpy-COOH)[17]及2-甲基-3-苯基苯并[g]喹喔啉(mpbq)[18]根據文獻合成。

1.2 配合物的合成

[(dfppy)2IrCl]2的合成：將0.3 g無水氯化銥(1.0 mmol)和 0.48 g(2.5 mmol)的 2-(2，4-二氟苯基)吡啶加入到6 mL的乙二醇乙醚和水的混合溶劑中(3∶1，V/V)，氮氣保護下回流24 h。反應結束后，冷卻至室溫。過濾、收集得到黃色沉淀，分別用乙醇和丙酮洗滌沉淀，然后將沉淀溶解于二氯甲烷中，過濾除去固體，將濾液旋轉蒸發除去溶劑，通過柱層析提純，得產物0.3 g(產率50%)。

[(mpbq)2IrCl]2的合成：方法同[(dfppy)2IrCl]2的合成，用0.65 g(2.5 mmol)2-甲基-3-苯基苯并[g]喹喔啉代替2-(2，4-二氟苯基)吡啶，得紅棕色產物0.15 g(產率49%)。

[(dfppy)2Ir(bpy-sugar)]Cl(1)的合成：將0.1 g[(dfppy)2IrCl]2(0.082 mmol)和0.1 g bpy-sugar(0.17 mmol)溶解于10 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中(1∶1，V/V)，氮氣下回流12 h，冷卻至室溫，旋轉蒸發除去溶劑。固體用少量甲醇溶解，過濾得黃色溶液，旋轉蒸發除去溶劑，再用甲醇溶解，這樣反復3次得黃色固體0.116 g(產率61%)。1H NMR(400 MHz，MeOD)：δ 8.87(s，2H，H-bpy)，8.39(d，J=8.3 Hz，2H，H-py)，7.97(dd，J=18.3，6.6 Hz，4H，H-py)，7.70(dd，J=31.7，5.3 Hz，2H，H-py，2H，H-bpy)，7.22(s，2H，H-py)，6.71(t，J=10.4 Hz，2H，H-ph)，5.74(d，J=7.8 Hz，2H，H-ph)，4.63(s，2H，OH)，4.34～4.23(d，2H，OH),4.18(s，2H，OH)，4.03(d，J=14.3 Hz，2H，OH)，3.85(t，J=10.7 Hz，2H，CH—S)，3.73～3.47(m，4H，CH2—S)，3.37(s，2H，H6-suagr)，3.34(s，2H，H6′-sugar，overlap with solvent peaks)，3.25(s，8H，H2-sugar，H3-sugar，H4-sugar，H5-sugar)。ESI-MS(m/z)：C46H44F4IrN4O10S2([M-Cl]+)計算值1 145.204 1，實測值1 145.206 4。元素分析按 C46H44ClF4IrN4O10S2·H2O 的計算值(%)：C 46.09，H 3.87，N 4.67；實測值(%)：C 46.35，H 3.82，N 4.70。

[(tpy-COOH)2Ir(bpy-sugar)]Cl(2)的合成：采用類似于配合物1的方法制備配合物2，不同之處在于用tpy-COOH代替dfppy，并以二氯甲烷/甲醇為洗脫劑在硅膠上通過柱層析純化得到產物。產物2為橙黃色固體(產率50%)。配合物經核磁共振波譜和質譜證實，與我們以前的文獻報道一致[19]。

[(mpbq)2Ir(bpy-sugar)]Cl(3)的合成：用[(mpbq)2Ir-Cl]2代替[(dfppy)2IrCl]2，方法同配合物1的合成。將0.1 g[(mpbq)2IrCl]2(0.065 mmol)和0.1 g bpy-sugar(0.17 mmol)溶解于10 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中(1∶1，V/V)，氮氣下回流12 h，冷卻至室溫，旋轉蒸發除去溶劑。固體用少量甲醇溶解，過濾得紅棕色溶液，旋轉蒸發除去溶劑，再用甲醇溶解，這樣反復3次得深棕色固體，柱層析純化得0.085 g(產率49%)。1H NMR(400 MHz，MeOD)：δ 8.63(d，J=6.4 Hz，2H)，8.58～8.39(m，4H)，8.16(d，J=9.7 Hz，2H)，8.08～7.92(m，4H)，7.86(d，J=5.6 Hz，2H)，7.58～7.00(m，12H)，6.96～6.76(m，4H)，4.07(d，J=13.9 Hz，4H)，3.92(s，2H),3.87～3.52(m,8H)，3.56～3.50(m，2H)，3.51～3.36(m，6H)，3.15(dd，J=34.6，24.2 Hz，8H)。ESI-MS(m/z)：C62H58IrN6O10S2([M-Cl]+)計算值 1 303.332 8，實驗值1 303.329 0。元素分析按C62H58ClIrN6O10S2·H2O 的計算值(%)：C 54.88，H 4.46，N 6.19；實驗值(%)：C 55.09，H 4.41，N 6.22。

1.3 銥配合物的光物理性質測試

準確稱量樣品，配成濃度為0.1 mmol·L-1的水溶液，在紫外可見分光光度計上進行檢測，稀釋濃度至各吸收峰的吸收值約為1.0，根據比爾定律計算得到摩爾吸光系數。配合物1和2的紫外可見吸收光譜和發射光譜均在水中測定，配合物3在H2O/DMSO(39∶1，V/V)中測定。

發光絕對量子產率用積分球測得。配合物1和2分別在水中測定，配合物3在H2O/DMSO(39∶1，V/V)中測定。空白溶劑分別為水或H2O/DMSO(39∶1，V/V)。瞬態發光光譜在FLS920上測試(激發光源：氫氣納秒閃爍燈，激發波長400 nm)。

1.4 銥配合物的細胞成像及毒性研究

1.4.1 細胞的培養

用DMEM(A)細胞培養基(粉末型)培養宮頸癌細胞(HeLa)，用含10%胎小牛血清、1%青霉素和鏈霉素的培養液在濕潤的CO2(體積分數5%)氣氛中配成單個細胞懸液，以每孔1 000～10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL，培養3 d。

1.4.2 細胞毒性研究

用MTT法來測試經銥配合物處理過的HeLa細胞活性。HeLa細胞用96孔組織培養板生長，密度是每孔4×106個，培養3 d。用銥配合物處理24 h后，培養板用培養液洗2次，然后加入MTT，在37℃下再培養4 h。隨后，除去上清液并加入DMSO，用微孔板分光光度計測定570 nm處的吸光度，用未經銥配合物處理的細胞作為對照。相對細胞毒性(cell viability，CV)用公式 CV=(ODsample-ODblank)/(ODreference-ODblank)×100%(OD為光密度)計算。收集3次重復實驗的數據，計算其標準偏差(SD)并用統計學的t-檢驗方法分析。當P值小于0.05時，該組數據才能被認為是位于有效的標準偏差范圍內。實驗中所用配合物為配合物1和2。

1.4.3 活細胞熒光成像研究

37 ℃下，HeLa細胞的培養基(1×105mL-1)在CO2(體積分數5%)氣氛下于35 mm組織培養皿中培養并使其粘附24 h。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細胞，然后在37 ℃下單獨與10 μmol·L-1銥配合物在DMSO/PBS(pH=7.4，1∶99，V/V)中培養 1 h，接著用DAPI(4，6-聯脒-2-苯基吲哚)進一步染色15 h后，小心用PBS(pH=7.4)沖洗2～3遍，然后進行細胞成像。用Axio-LSM-700共聚焦熒光顯微鏡進行磷光成像拍攝并觀察。

2 結果及討論

2.1 銥配合物的合成表征

利用羥基糖聯吡啶作為輔助配體，合成了3種銥（Ⅲ）配合物。合成過程包含2步：第一，通過Nonoyama反應進行雙核環金屬銥二氯體[Ir(C^N)2Cl]2的合成；第二，羥基糖聯吡啶配體與二聚體[Ir(C^N)2Cl]2發生配位得到目標銥（Ⅲ）配合物。合成的目標配合物通過核磁共振氫譜、高分辨質譜和元素分析進行了表征，表征結果與目標配合物一致。

我們還通過傅里葉變換紅外光譜對3個銥配合物進行了表征。從圖2中可以看出，配合物1在3 155 cm-1處的振動峰對應為糖配體上的羥基伸縮振動，1 598 cm-1處的振動峰對應苯環上C=C伸縮振動，1 403 cm-1對應C—F的伸縮振動，但1 400 cm-1處還覆蓋著糖上C—O的伸縮振動。在配合物2中，3 361 cm-1處的寬峰對應為羧基以及糖配體上的羥基伸縮振動共同作用，1 695 cm-1對應為羧基上C=O的伸縮振動，1 615 cm-1對應苯環上C=C伸縮振動，1 386 cm-1對應糖配體上C—O的伸縮振動。配合物3在3 393 cm-1處的峰對應為糖配體上的羥基伸縮振動，1 380 cm-1對應為糖配體上C—O的伸縮振動。由3個配合物對比可知配合物2明顯多了一個C=O的伸縮振動吸收峰(1 695 cm-1)。與沒有糖基的金屬銥配合物相比[20]，這一類型的配合物在紅外光譜3 100～3 400 cm-1處有一個非常明顯的糖基上羥基振動的特征吸收峰。

圖2 制備的金屬銥配合物的紅外吸收光譜圖Fig.2 Infrared absorption spectra of as-prepared iridium（Ⅲ）complexes

2.2 銥配合物的光物理性質

2.2.1 銥配合物的紫外可見吸收光譜

含糖基的銥配合物能較好地溶于水，3種修飾有糖基的銥配合物在水中的光物理數據列在表1中，其在水中的紫外可見吸收光譜如圖3a所示。參考相關報道[21]，配體上連接吸電子基團，能夠有效地影響配體內電荷轉移(ILCT)、金屬到配體電荷躍遷(MLCT)以及配體到配體電荷躍遷(LLCT)，從而調節配合物的吸收和發射性質。從圖3可以看出配合物1和2在215～320 nm處有強的吸收(摩爾吸光系數為104dm3·mol-1·cm-1數量級)，且配合物 1在約 355 nm處有相對較弱的吸收。根據環金屬銥亞胺配合物的報道[22-23]，在215～320 nm處強的吸收可歸屬為配體的分子內躍遷(1IL)π-π*(N—N和N—C)，350～432 nm區域的次強的低能級吸收可歸屬于自旋允許的金屬到配體的電荷躍遷(1MLCT)dπ(Ir)-π*(N—N)，這是環金屬銥亞胺配合物的特征吸收。與配合物1和2對比，配合物3在465～510 nm有弱吸收。配合物3的環金屬配體具有最大的共軛結構，其配體π*能級更低，因此金屬到配體的MLCT吸收峰紅移。實驗結果表明通過選擇不同的配體結構能調控配合物的最低激發態能級，因此配合物含有不同共軛程度的環金屬配體的MLCT吸收峰不同。另外，新合成的銥配合物的吸收光譜在24 h內沒有明顯的變化，表明它們在水溶液中有很好的穩定性。

圖3 糖基銥（Ⅲ）配合物的紫外可見吸收光譜圖(a)和發射光譜圖(b)Fig.3 UV-Vis absorption spectra(a)and emission spectra(b)of the glycosyl iridium（Ⅲ）complexes

表1 糖基銥（Ⅲ）配合物的光物理數據Table 1 Photophysical data of the glycosyl iridium（Ⅲ）complexes

2.2.2 銥配合物的發射光譜

在400 nm激發下含糖基的配合物1和2在除氧后的水溶液中有強烈的發光，配合物3則相對較弱，最大發射波長如圖3b所示，分別為546 nm(1)、584 nm(2)、780 nm(3)。配合物1和2的發光波長與其他的環金屬銥配合物類似，在可見光區540～580 nm發射出強的黃色光，而配合物3與大多數的環金屬配合物不同，具有近紅外光發射特征。參考文獻中其他環金屬銥配合物的發光光譜[24-28]，這些強的發射光譜可歸因于自旋禁阻的金屬到配體三重激發態電子轉移(3MLCT)dπ(Ir)-π*(ligand,bpy-sugar)。另外，可能還混有自旋禁阻的配體內電子轉移(3IL)(ππ*)。銥配合物有良好的發光顏色可調的性質，選擇不同的配體或配體上修飾不同的基團，可改變銥配合物的發光波長。從表1中可以看出，選擇不同共軛結構的環金屬配體，配合物的發射波長不同：2-(2，4-二氟苯基)吡啶(dfppy)的金屬配合物(1)最大發射波長546 nm，4-(2′-吡啶基)苯甲酸(tpy-COOH)的金屬配合物(2)最大發射波長584 nm，2-甲基-3-苯基苯并[g]喹喔啉(mpbq)的金屬配合物(3)最大發射波長780 nm，接近近紅外區。這是由于羧基以及氟的吸電子作用，可以使得銥的dπ軌道更穩定，因此增大銥的dπ到配體bpy-sugar的π*軌道之間的能級間隔，使發射波長產生藍移。同時2-甲基-3-苯基苯并[g]喹喔啉共軛離域大，降低了配體的π*，會導致減小銥到C^N配體的π*軌道之間的能級間隔，使得發光波長產生紅移。合成得到的配合物具有不同的發射波長進一步說明了銥配合物良好的發光波長可調節性。同時我們也測試了銥配合物的發光量子產率(λex=436 nm)和壽命，數據列于表1。在未除氧的水溶液中配合物1有很高的發光量子產率，大概是經典三聯吡啶釕的水溶液發光(φem=0.042)[29]的4倍，壽命為0.22 μs。相對來說，配合物2發光量子產率低很多，壽命也稍短，分別為3.1%和0.10 μs。而含有大共軛的環金屬銥配合物3發光很弱，積分球無法獲得準確的量子產率。但是其在近紅外光區的發光特點使其有望作為近紅外探針應用于生物分析，因為目前在近紅外光區發光的金屬銥配合物非常少。可以通過納米材料或聚合物包埋等方法提高3的發光效率。

2.3 銥配合物的毒性研究及細胞成像

通過MTT法測定制備的銥配合物培養過的HeLa細胞活性可以得到這些銥配合物對細胞活性的影響，該方法采用配合物1和2的DMSO/PBS(1∶99，V/V，pH=7.4)混合溶液分別對HeLa細胞培養24 h。

如圖4細胞所示，當濃度低于100 μmol·L-1的配合物1和2培養細胞24 h后，大約有大于70%的HeLa依然存活，這表明這些配合物的細胞毒性在可接受的范圍內。對比一些其他的金屬配合物的細胞毒性試驗，制備的2個配合物在如此大的濃度下，細胞卻還能有如此高的活性，說明羥基糖配體對于降低這類金屬配合物的細胞毒性是有所幫助的，這為提高這類配合物在生物上的研究奠定了基礎。

圖4 配合物1和2培養下的HeLa細胞活性Fig.4 HeLa cell viability cultured with complexes 1 and 2

細胞吸收是探針能否成功的關鍵[30-31]。HeLa細胞被培養在 10 μmol·L-1的銥配合物溶液中 1 h，多余的染料用緩沖溶液沖洗干凈，共聚焦成像如圖5所示。從圖上可看出，金屬銥配合物能夠穿過細胞膜，進入到細胞，且與DAPI染色的細胞核部分有所重合，說明銥配合物進入到了細胞核。同時配合物的發光情況良好，說明在細胞所在的生物環境中，配合物仍是穩定的。而在細胞質中也觀察到配合物的存在，說明這2個銥配合物對于細胞器定位的專屬能力還不夠，未見明顯定位。與未修飾F或者COOH的糖基金屬銥配合物[32]相比，這2個配合物都能穿過細胞膜，表明F或者COOH基團在提高糖基金屬銥配合物的細胞穿透性方面有重要作用，具體的進入方式還有待進一步研究。通過修飾糖基配體，增大銥配合物的水溶性，并使得其能進入細胞內部，這為金屬銥配合物作為生物探針奠定了重要的基礎。

圖5 HeLa細胞在配合物溶液中培養后的染色與共聚焦成像照片Fig.5 Staining and confocal imaging photos of HeLa cells cultured in the solution of complex

3 結論

合成了3種新型的水溶性銥配合物，通過核磁共振氫譜、質譜、紅外光譜和元素分析對銥配合物進行了表征，結果與目標配合物一致，之后用發光成像等手段研究了其在生物研究方向的應用。利用紫外可見吸收光譜和發光光譜研究了其光物理性質。通過選擇羥基糖配體，以及引入一些吸電子基團，有效地調節了銥配合物的光物理性質和水溶性。水溶性的提高，有利于銥配合物在生物分析上應用的前景。通過細胞實驗研究發現，羥基糖配體的引入很好地降低了銥配合物的細胞毒性；而羧基或者氟基團的引入不但調控了配合物的發光波長，還提高了分子的細胞穿透性，使得發光金屬銥配合物作為細胞探針成為可能。