過氧化氫參與調控擬南芥根部向水性的研究

王 宇, 韓 毅

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

干旱是地球上最嚴重的非生物脅迫之一,嚴重影響作物生長及產量,導致農業經濟巨大的損失[1]。植物的根系是最先感受到干旱的,而干旱會對植物根系造成無法挽回的損傷[2]。植物的根系會避開土壤中缺水干旱的地方,自發地向水勢高的區域生長,這是植物根系的向水性(hydrotropism)生長[3-5]。但是植物的向水性調控網絡目前還不清楚,因此尋找該調控網絡的關鍵信號分子能夠大大豐富植物抗旱的機制。

活性氧通常在植物細胞體內作為細胞反應的調節分子,參與植物的生長發育和向性生長等活動過程的調節[6]。而過氧化氫(H2O2)作為細胞產生的一種活性氧,是動植物細胞響應各種應激反應的重要信號分子,也是植物在受到各種生物和非生物脅迫下的重要信號分子。H2O2對于感知逆境信號,激活植物下游防御系統來應對環境脅迫起著至關重要的作用,而且還能夠傳導調控一系列脅迫應答[7]。H2O2是否參與植物根部向水性的調控尚不清楚。

為了探究H2O2信號和植物根部向水性之間的關系,本研究采用代謝H2O2的2個關鍵酶的擬南芥突變體,分別為過氧化氫酶(catalase)突變體cat2和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase)突變體apx1。通過放大H2O2的信號,研究脅迫環境下H2O2信號和向水性之間的相關性。為了模擬干旱脅迫,本研究采用山梨醇(sorbitol)配置滲透脅迫培養基，模擬干旱脅迫下水勢的差別。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

實驗所使用的擬南芥種子均購自美國擬南芥種子中心,擬南芥(Arabidopsisthliana)哥倫比亞野生型(Col-0),過氧化氫酶2(cat2)缺失突變體和抗壞血酸過氧化物酶(apx1)突變體。轉基因植株為DR5::N7-VENUS和cat2DR5::N7-VENUS[8]。

1.1.2 儀器與試劑

主要試劑有MURASHIGE&SKOOG MEDIUM、MES、蔗糖、山梨醇、Agar、無菌水、高樂士(主要成分次氯酸鈉)。

主要儀器有高溫高壓滅菌鍋、恒溫光照培養箱、超凈工作臺、分析天平、激光共聚焦顯微鏡、掃描儀、方形培養板等。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥種子的滅菌

整個過程在超凈工作臺中工作,先將適量的擬南芥種子裝入1.5 mL離心管中,用70%的乙醇清洗3 min,隨后用無菌槍頭將乙醇吸出,再用25%的高樂士清洗10 min;然后用無菌水清洗5次,每次5 min;最后用無菌的槍頭將種子點在配好的1/2MS培養基上。

1.2.2 擬南芥的種植過程

將種子點在1/2MS培養基后,放置于4 ℃冰箱春化3 d后,拿出放在人工氣候培養間培養,培養板垂直放置。待種子生長至5 d后,用無菌鑷子將萌發的幼苗移到相應的脅迫培養板上。

擬南芥光照周期為長周期(16 h光照,8 h黑暗);溫度為白天22 ℃,夜晚18 ℃;濕度為65%。

1.2.3 滲透脅迫培養基的配置

待1/2MS培養基冷卻后,用滅菌的刀片將白線以下的1/2MS培養基切除,然后將配置好的滲透脅迫培養基倒入,靜置20 min等培養基自然冷卻凝固。

1.2.4 雜交轉基因突變體

利用cat2和DR5::N7-VENUS分別為母本和父本進行雜交,將DR5::N7-VENUS的花粉涂抹在cat2的柱頭上雜交獲得F1代,將F1代種下,經過擬南芥本身的自交產生F2代。通過鑒定獲得純合的cat2DR5::N7-VENUS。

1.2.5 生長素熒光信號的測定

通過激光共聚焦顯微鏡觀察DR5::N7-VENUS和cat2DR5::N7-VENUS的根尖生長素熒光信號。激發波長為488 nm。

2 結果與分析

2.1 脅迫培養模式

擬南芥在滲透脅迫培養基中生長的模式如圖1所示。采用垂直板培養。圖1中,白線以下為配置的脅迫培養基,將生長5 d的擬南芥幼苗用無菌鑷子移至白線處,根尖緊挨著白線處界限。

圖1 脅迫處理擬南芥模式

將生長5 d大小的擬南芥幼苗按照模式圖移至脅迫培養基上,6 h后發現擬南芥幼苗的根尖發生向水性彎曲,其表型如圖2所示,從圖2可看出,在正常1/2MS培養基上生長的野生型擬南芥(Col-0)根尖表現出繼續往下生長,而在0.4 mol/L山梨醇培養基上的Col-0根尖避開了加山梨醇的培養基,根尖彎曲朝著水勢較高的正常1/2MS培養基生長。

圖2 脅迫處理下根尖的表型

本文將重力方向定義為0°,統計根尖與重力方向的夾角,取10°為一個范圍，朝右彎曲定義為正值,根尖向水彎曲角度如圖3所示。圖3中圓圈的數字代表統計苗的個數,細長矩形代表該彎曲角度占統計擬南芥總數的比例。由圖3可知，在統計的對照組中-5°～5°范圍內有21棵,5°～15°有2棵,-15°～-5°有1棵,-25°～-35°有2棵,-45°～-55°有2棵;在0.4 mol/L 山梨醇培養基上的擬南芥幼苗在5°～15°有7棵,15°～25°有6棵,25°～35°有8棵,35°～45°有10棵,45°～55°有4棵。后續均用該模式統計。

圖3 脅迫處理下根尖向水彎曲角度

2.2 山梨醇處理Col-0、cat2、apx1的研究

植物在受到脅迫時,體內會產生大量的H2O2,因此,用濃度為0.4 mol/L 山梨醇的滲透脅迫培養基按照圖1的模式配置脅迫培養板。將Col-0、cat2和apx1按照圖1模式移苗,其表型如圖4所示。

圖4 山梨醇處理Col-0、cat2和apx1后根尖的表型

由圖4可知，經過24 h后,發現cat2突變體和apx1突變體的根尖都保持了向水性的彎曲,但是Col-0根尖已經生長進入了山梨醇培養基,并沒有保持向水性。結果顯示,與Col-0相比,cat2和apx1明顯能保持向水性現象更加持久。本文統計了24 h后Col-0、cat2和apx1株系根尖彎曲角度,如圖5所示。

由圖5可知,野生型根尖已經朝著重力方向生長,而cat2和apx1的根尖仍然保持向水性的彎曲生長。

圖5 山梨醇處理Col-0、cat2和apx1后根尖向水彎曲角度

2.3 根尖生長素信號的檢測

研究發現,生長素能夠調控根部的向地性[9]。為了進一步探究H2O2在擬南芥根部對向水性的調節作用,本文使用生長素合成誘導的轉錄標記基因DR5::N7-VENUS來檢測根部生長素信號的強弱,利用激光共聚焦顯微鏡觀察DR5::N7-VENUS和cat2DR5::N7-VENUS的根尖生長素熒光信號，如圖6所示。

圖6 cat2、Col-0根尖生長素熒光信號

經過計算，統計2個株系根尖的熒光強度值如圖7所示。

由圖7可知，與野生型背景的DR5::N7-VENUS相比,cat2DR5::N7-VENUS的根部生長素熒光強度要弱得多。

圖7 cat2、Col-0根尖生長素熒光強度

3 討 論

研究表明植物的根部在受到滲透脅迫時,根部會遠離滲透脅迫區域,朝著正常水勢的方向生長,即根部會自發地進行向水性彎曲。H2O2是一種重要的植物內源信號分子,參與調控多種非生物脅迫和生物脅迫。然而,H2O2信號是否調控植物根部向水性目前還不清楚。過氧化氫酶是代謝植物體內H2O2的關鍵酶[10-11]，因此過氧化氫酶缺失突變體是研究H2O2與向水性的重要遺傳材料。本研究發現,與Col-0相比,cat2和apx1能夠保持向水性更久;結果表明H2O2可能參與了向水性的過程。之后觀察cat2根尖的生長素信號,發現cat2的根尖生長素信號明顯比Col-0的根尖生長素信號低。

以上結果表明,H2O2可能是連接滲透脅迫引起向水性現象的中間信號分子,并且根部的彎曲生長可能與生長素的調控有關[12]。向水性現象的出現是因為脅迫環境下根尖的向地性被減弱了,而H2O2是重力信號的傳遞分子,所以 H2O2信號分子是通過影響根部向地性去發生向水性現象還是通過其他途徑有待進一步研究。