果蠅鐵蛋白H型亞基-His融合蛋白的原核表達

葉佳偉, 肖桂然

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

鐵蛋白Ferritin(CG2216)是一個24亞基的空心球體復合物,可以容納數(shù)千個鐵原子,并以一種無毒的、生物可利用的形式存在,被認為是分子水平上主要的鐵存儲蛋白[1-2]。根據(jù)相對分子質量的大小,鐵蛋白由H型(重鏈)亞基和L型(輕鏈)亞基2種組成,H型亞基的特征是一個保守的氧化鐵酶位點,有利于亞鐵的快速氧化和吸收,L型亞基促進鐵素體鐵芯的成核[3]。

在哺乳動物中,鐵蛋白主要存在于細胞質中,盡管缺乏分泌信號,但哺乳動物的鐵蛋白可以在血液循環(huán)中找到[4]。因此人體內血清鐵蛋白濃度是判斷體內鐵貯存量的重要指標。在診斷缺鐵性貧血、鐵負荷過度和營養(yǎng)狀況調查過程中都有重要意義。同時,各種惡性腫瘤患者血清鐵蛋白增高,其中以白血病和惡性淋巴瘤增高最為顯著;肝癌、胰腺癌、乳腺癌患者的鐵蛋白均有增高。鐵蛋白在滲出性胸腹水高于漏出性胸腹水,可用于滲出液與漏出液的鑒別，并且鐵蛋白的同期胸腹液(P)/血清(S)比值在惡性胸腹水病例中明顯升高,是鑒別良惡性胸腹水的一個指標[5-7]。有多項研究通過基因工程方法在鐵蛋白外表面連接特定的肽段或者熒光探針,用于活體細胞成像,例如Lee研究組通過一個富含甘氨酸的肽段將綠色熒光蛋白(GFP)整合到人H亞基鐵蛋白外表面,增大了熒光強度并提高了穩(wěn)定性,再利用化學修飾連接DNA適體用于腫瘤標志物的檢測,其檢測靈敏度顯著增強[8-9]。

黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)是經(jīng)典的模式生物之一,其微量元素代謝過程與哺乳動物相比有較高的保守性, 哺乳動物許多微量元素代謝相關的蛋白都能在果蠅中找到同源物,果蠅作為模式生物,用其研究微量元素的代謝有其獨特的優(yōu)勢[10]。鐵蛋白H型亞基(Fer1HCH)在昆蟲中不僅參與鐵吸收,同時參與鐵解毒,并且許多參與ATP生產、光合作用和DNA生物合成的關鍵酶都需要鐵硫簇才能發(fā)揮作用[11]。在果蠅和很多其他昆蟲中,H型亞基具有亞鐵氧化酶(ferroxidase)活性,是人類Fer1HCHH亞基的同源物,因此也被命名為 heavy chain homolog(Fer1HCH),仍然歸類為H型亞基,另一種起到促進晶核形成作用的亞基則被命名為light chain homolog(Fer2LCH),歸類為L型亞基。果蠅的鐵蛋白H型亞基和L 型亞基結構和功能目前仍不明確。

為了探究果蠅的Fer1HCH H 型亞基的分子結構和功能,本文通過基因工程手段得到體外表達的蛋白His-Fer1HCH,對于進一步探究該蛋白的結構、性質以及調控是至關重要的,為后續(xù)實驗的開展奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌和載體

大腸桿菌感受態(tài)菌株BL21、Transt1和PET-28a載體由合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院分子營養(yǎng)學實驗室繁衍保存。

1.1.2 主要試劑

EasyTaq DNA Polymerase、BamHⅠ和NotⅠ限制性快速內切酶、T4 DNA Ligase、6×DNA loading buffer、dNTP mix、Trans2K Plus DNA Marker、T4 DNA Ligase buffer、預染分子量標準蛋白Marker，均購于北京全式金生物技術有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素、考馬斯亮藍R-250,均購于碧云天公司;無菌水、瓊脂糖、1×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠儲存液。

1.1.3 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋購于上海精宏實驗設備有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋購于北京勤誠盛達科學儀器有限公司;凝膠成像系統(tǒng)購于上海天能科技有限公司;超凈工作臺購于上海智城分析儀器制造有限公司;超低溫冰箱購于Thermo Fisher scientific;高速冷凍離心機購于Beckman Coulter,USA;恒溫培養(yǎng)振蕩器、基因擴增儀、脫色搖床、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

(1) LB液體培養(yǎng)基的配制。稱取2 g蛋白胨,1 g酵母粉及2 g NaCl,加入160 mL ddH2O,用NaOH調pH值至7.0～7.3,定容至200 mL,121 ℃高壓滅菌20 min。

(2) LB固體培養(yǎng)基的配制。100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入1.2 g瓊脂粉,121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 Fer1HCH原核表達載體的構建

(1)Fer1HCH基因的獲得。利用Primer Premier 5.0軟件設計所需引物,Fer1HCH表達載體選用BamHⅠ和NotⅠ2個酶切位點。所需引物如下:

FP:5’GGAATTCATGGTGAAACTAATTGCTAGCCTG,

RP:5’ATAAGAATGCGGCCGCCAGGGTCTTGTCGAACAGG。

以cDNA為模板,用高保真擴增酶進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增。

(2)Fer1HCH基因與載體的重組。將回收的目的基因以及PET-28a載體用限制性內切酶BamHⅠ和NotⅠ在37 ℃下進行雙酶切;用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接；將連接過夜的產物轉入到大腸桿菌克隆感受態(tài)細胞中，用含有100 mg/mL氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆；挑取單克隆菌落進行PCR鑒定；測序，若鑒定正確則保菌。

(3)Fer1HCH基因原核表達載體的誘導表達。37 ℃擴大培養(yǎng),當菌液到達指數(shù)期加入質量濃度為100 mg/mL IPTG誘導劑25 ℃誘導4 h,并且留一份不加IPTG的菌液作為對照;對表達菌進行破碎,留取全蛋白、上清沉淀及誘導前的樣品進行考馬斯亮藍染色。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增Fer1HCH基因

以cDNA為模板擴增Fer1HCH基因片段,結果如圖1所示,圖1中,M為DNA Marker;1為Fer1HCH基因PCR產物。由圖1可知,樣品PCR擴增出了DNA片段,且在500～750 bp之間有一條明顯條帶。與期望得到的Fer1HCH結構基因片段相符,初步推斷已擴增出目的基因片段。

圖1 PCR擴增目的片段

2.2 Fer1HCH表達載體的連接與轉化

用限制性內切酶BamHⅠ和NotⅠ切割目的基因和PET-28a載體,酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖2所示,圖2中,M為DNA Marker;1為Fer1HCH基因PCR產物;2為載體酶切產物。

圖2 基因與載體酶切回收后的電泳檢測結果

從圖2可以看出,目的基因和載體均已發(fā)生雙酶切并獲得酶切產物,酶切后的基因和載體條帶清晰、大小正確,可以進行下一步實驗。

將酶切過的基因和載體用T4 DNA連接酶于16 ℃水浴中過夜連接,然后將重組質粒轉入克隆感受態(tài)Transt1中,用含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板篩選陽性單克隆,如圖3所示,由圖3可知，大腸桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形,邊緣整齊,表面光滑,凸起,由此可以判斷平板上生長的是大腸桿菌,且未被雜菌污染。

圖3 轉化至Transt1后的克隆載體大腸桿菌

挑取單克隆進行菌落PCR鑒定并進行電泳檢測,Fer1HCH表達菌株的菌落PCR鑒定結果如圖4所示,從圖4可以看出，挑選的單菌落均為陽性菌落，擴增后條帶大小也正確。圖4中,M為DNA Marker;1～16為單菌落克隆(Fer1HCH基因PCR產物)。

圖4 菌落PCR的電泳圖

2.3 質粒菌的轉化及目的蛋白的定性測量

將測序成功的陽性克隆的重組質粒提取出來轉入到表達載體BL21中,并對表達菌進行培養(yǎng),如圖5所示,由圖5可知，大腸桿菌的轉化效果良好。

圖5 轉化至BL21后的克隆載體大腸桿菌

加入100 mg/mL IPTG的誘導劑在25 ℃誘導4 h,讓菌株表達目的蛋白,對細菌表達的蛋白進行考馬斯亮藍染色實驗,結果如圖6所示。圖6中紅色方框區(qū)域表示目的蛋白,結果顯示不加 IPTG 誘導時,目的蛋白也能表達。經(jīng)過多次實驗證明并非操作過程中出現(xiàn)了問題,而有可能是由于使用的表達感受態(tài)細胞 BL21在表達某些蛋白時也會出現(xiàn)泄漏表達的情況。與蛋白Marker對照可知,Fer1HCH融合蛋白的大小為27 kDa。將上述表達質粒作蛋白的可溶性分析，圖6中黑色方框所示為超聲碎菌后全蛋白、上清液以及沉淀3份樣品分別通過SDS-PAGE觀察表達結果，表明導入的Fer1HCH基因已成功表達。通過對不同部位的溶液進行檢測,根據(jù)染色后的電泳圖條帶分析,得知Fer1HCH的種類有可溶性和非可溶性之分。圖6中,M為蛋白 Marker;1為質量濃度100 mg/mL IPTG誘導的產物;2為未誘導對照;3為總蛋白;4 為上清蛋白;5為沉淀蛋白。

圖6 蛋白考馬斯亮藍染色

3 討 論

本實驗構建表達Fer1HCH的大腸桿菌載體,并且得到預期結果,并利用His標簽與裝備金屬離子的層析介質結合,通過提高咪唑緩沖液的質量濃度對目的蛋白進行競爭性洗脫,最終獲得純化后的His標簽蛋白。

本文通過構建大腸桿菌表達載體,能更方便地研究帶有Fer1HCH的蛋白性質。同理,可以將其他在動物或植物體內難于表達的基因通過體外克隆,轉入到表達載體,更方便地獲得目的產物,為今后的研究奠定堅實的基礎。

除此之外,還可以進行表達載體的優(yōu)化表達實驗。以本實驗為例,可以研究在不同的誘導條件下的Fer1HCH產量。例如,是否添加IPTG及其質量濃度、誘導的時間和誘導的溫度對目的蛋白表達的影響,從而獲得誘導蛋白的濃度更高、活性更強的目的蛋白。