牡丹皮提取物抑菌性能及其在漱口水中的應用研究

胡永志 黃柳云 李江平 韋玉金 梁瑩瑩

(柳州兩面針股份有限公司，545001)

據統計，我國人群口腔患病率達80%以上，并已威脅到各個年齡的人群，口腔護理迫在眉睫。常見的口腔問題包括齲病、牙周炎等。具相關研究顯示，口腔菌屬的分類也較細, 以厭氧菌為多。其中，齲病的主要致病菌為變形鏈球菌，是造成齲齒的主要原因；牙周炎的主要致病菌為牙齦卟啉單胞菌，其可能作為內源性致病菌在特定條件下過度生長而導致牙周破壞，同時也是口臭主要致病厭氧菌，甚至是成人失牙的主要原因。這些口腔問題的存在，會進一步破壞牙齒硬組織和牙齒周圍支持組織，除影響咀嚼、言語、美觀等功能外，還會引起社會交往困難和心理障礙；甚至有些微生物長期存在于口腔中，可導致或加劇某些全身疾病如冠心病、糖尿病、胃病等，危害全身健康，影響生命質量。

要預防口腔疾病最簡單有效的方法是注意口腔衛生。選擇合適的口腔護理產品可以有效地控制口腔有害細菌增長，使我們在日常生活中輕松地預防口腔疾病的發生。植物是傳統醫學的天然藥物的重要來源，來源于植物的抗菌物質受到了廣泛關注。例如，由植物牡丹皮提取的丹皮酚，相比之下更安全，毒副作用和刺激性更小，不易引起人體微生態系統失調的狀況。

當前，人們在日常生活中清潔口腔時使用頻率最高的即為牙膏和漱口水，且漱口水近年來在人群中的消費勢頭越來越高，使用頻率也逐年增加。故本實驗選用漱口水作為配方基底，添加植物牡丹皮提取的丹皮酚，通過分析其對變性鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌的MIC值，以及對細菌細胞生長曲線抑制性能的研究，結合漱口水中保濕劑、增溶劑、香精等基底配方研究，開發出具有抑菌性能的植物漱口水。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

丹皮酚：本實施例采用的牡丹皮提取物，是牡丹皮原藥經水蒸氣蒸餾提取后，抽濾后得到粗結晶，再按照粗結晶∶95%乙醇∶純化水=1∶4∶15的比例，對粗結晶進行純化，0℃冷卻靜置48h，析出針尖狀結晶且含量>90%的丹皮酚成分。

菌種：牙齦卟啉單胞菌(ATCC 33277)、變形鏈球菌(ATCC 25175)標準菌種，由廣東省微生物分析檢測中心提供。

培養基：BHI液體培養基、BHI固體培養基，廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液體培養基除氧

在培養基配置時，添加厭氧指示劑刃天青，液體培養基含氧時指示劑變粉紅色，低氧至無氧時無色；使用99.99%純度氮氣進行培養基充氮除氧，以0.1～0.15L/min，30min的流速和時間進行充氮處理，經過高溫滅菌后所得低含氧或無氧的BHI液體培養基。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)

菌懸液的制備：將試驗菌48h BHI液體培養物用除氧液體培養基稀釋，制成所需菌懸液(要求的濃度為：用加樣器取1μL～2μL菌懸液點種于固體培養基的表面，接種后所形成的菌液圈直徑約為5mm～8mm，每點菌液圈回收菌數為1×104～9×104cfu/mL)。

采用瓊脂稀釋法以及點種法，進行對倍稀釋，測試5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、濃度下丹皮酚的最小抑菌濃度。以不含丹皮酚成分的BHI固體培養基平板作為對照組，最后將點種有菌液的平板放置于厭氧袋中，37℃下厭氧培養18～24h，菌落生長被完全抑制的最低抵抗菌液濃度為該樣品的對受試菌的MIC值。

1.2.3 抑菌實驗

采用細胞生長曲線監測法進行抑菌效果測試。以漱口水中丹皮酚有效含量值配制成細菌培養液，作為試驗組；以不含丹皮酚的細菌培養液，作為對照組，35℃～37℃培養，厭氧條件下，每間隔1小時，利用紫外分光光度計測定一次OD值，代表測試細菌濃度及生長情況。其中，牙齦卟啉單胞菌(ATCC 33277)測定波長為450nm，變形鏈球菌(ATCC 25175)測定波長為600nm。樣品組生物生長曲線低于對照組生物生長曲線，標識為在該濃度下對細菌生長起到抑制作用，具有抑菌效果。

2 結果與討論

2.1 最小抑菌濃度(MIC)試驗結果

經實驗發現，丹皮酚不能完全溶解于培養基中，會有晶體析出。故在進行實驗前先用一定濃度的乙醇對丹皮酚進行溶解、稀釋。首先測定乙醇對牙齦卟啉單胞、變形鏈球菌的MIC值，再確定該濃度下丹皮酚的溶解度，最后使用低于其MIC值并能完全溶解丹皮酚的乙醇濃度作為溶劑，以消除乙醇對丹皮酚抑菌效果的影響。

由表1可知，乙醇濃度<5%時，對牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌無抑菌作用；濃度為4%～5%時，能完全溶解相應濃度丹皮酚。故選擇4%～5%濃度的乙醇作為丹皮酚在固體培養基的溶解劑進行丹皮酚MIC實驗。由表2可知，丹皮酚對供試菌牙齦卟啉單胞菌的抑菌MIC值范圍為0.625～1.25mg/ml，對供試菌變形鏈球菌的抑菌MIC值范圍為1.25～2.5mg/ml。

表1 不同濃度乙醇對牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌的MIC值

表2 不同濃度丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌的MIC值

2.2 抑菌漱口水配伍研究及抑菌效果

2.2.1 抑菌漱口水配伍研究

甘油、泊洛沙姆、薄荷腦等原料在口腔護理產品中已經廣泛運用，并且類似于甘油等保濕劑顯示出一定的抑菌活性[1]。現將丹皮酚與漱口水基底配方進行配伍性能研究，在保證抑菌活性的同時，可保證漱口水自身的穩定性。

將丹皮酚與漱口水基底配方進行不同梯度配伍，在不引起漱口水理化指標改變的同時，從成本、口感等方面考慮，確定丹皮酚添加比例為0.05% ～0.25%，配制成植物抑菌漱口水。

表3 丹皮酚抑菌漱口水配方組成

2.2.2 抑菌實驗結果

鑒于所提取的丹皮酚對受試菌的MIC值測試結果，所制得植物抑菌漱口水的抑菌效果分別如圖1和圖2所示。可以發現，實施例1中，所含丹皮酚有效含量值，對牙齦卟啉單胞菌的生物細胞生長曲線具有明顯的抑制效果；對變形鏈球菌的生物細胞生長曲線有抑制效果，能降低其繁殖速率及生長時間。實施例4中，所含丹皮酚有效含量值，均對牙齦卟啉單胞菌以及變形鏈球菌的生物細胞生長曲線具有明顯的抑制效果。

圖1 丹皮酚對的牙齦卟啉單胞菌抑菌試驗結果

圖2 丹皮酚對的變形鏈球菌抑菌試驗結果

3 結論

本研究對由植物牡丹皮提取的含量>90%的丹皮酚進行了MIC值測試，以及與漱口水基底復配后有效含量值的抑菌效果分析。結果顯示：牡丹皮提取物丹皮酚，對牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌顯示出具有一定的抑菌活性，對牙齦卟啉單胞菌的抑菌作用優于對變形鏈球菌的抑菌效果；其中：丹皮酚對供試菌牙齦卟啉單胞菌的抑菌MIC值范圍為0.625～1.25mg/ml，對供試菌變形鏈球菌的抑菌MIC值范圍為1.25～2.5mg/ml。將丹皮酚按0.05%～0.2%的比例添加到漱口水基底配方中，發現抑菌效果隨丹皮酚含量的增加而增高，顯現出較強的抑菌性能，得到具有有效抑菌效果的抑菌漱口水。

植物抑菌漱口水，是性能安全、有效的含植物抑菌物的口腔護理產品，其在發揮抑制口腔有害菌的同時，減少耐藥性的產生，能降低化學劑用量及刺激性，達到保障口腔清潔衛生健康、維護口腔微生態平衡的目的，符合并滿足廣大人民群眾日常的迫切需求，該技術的市場應用前景廣闊，必會受到廣大消費者青睞。