CRISPR/Cas9基因敲除研究進展

白祥慧

（青海師范大學生命科學學院，青海 西寧 810008）

探索基因在信號通路中的作用是生命科學研究領域的熱點問題之一[1]?；蚯贸夹g是一種可以驗證基因功能的新型技術手段[2]，是驗證基因功能的常用標準[3-4]。CRISPR/Cas9系統作為一種新型基因編輯技術，可以精確、高效地對基因組進行敲除或修飾，可在較短時間內獲得基因敲除突變體，從而更好地完成基因功能的研究[5]。CRISPR/Cas9技術極大地擴展現有模式生物基因操作的可能性，已成為構建新動物模型必不可少的工具。因此，基因組編輯對重要農業物種的發展具有積極作用，如山羊、綿羊、豬和奶牛的育種。使用CRISPR/Cas9系統可編輯具有復雜基因組結構的新模式生物[6]。文章綜述近年來CRISPR/Cas9的應用進展。

1 CRISPR/Cas9基因敲除作用機理

CRISPR/Cas9系統由一個單體蛋白和一個嵌合RNA組成。序列特異性由gRNA中的20NT序列賦予，裂解由Cas9蛋白介導[7]。CRISPR/Cas9是一種編輯效率較高的新型基因靶向修飾技術，該技術可通過一段sgRNA來識別靶位點，利用Cas9蛋白進行切割，產生雙鏈DNA斷裂。真核生物可以通過非同源末端連接修復方式和同源重組方式進行自我修復，從而達到高效的基因編輯效果。CRISPR/Cas9胚胎顯微注射移植法引導Cas9裂解酶裂解相應基因，從而刪除外顯子核苷酸，構建基因敲除模型。

2 CRISPR/Cas9基因敲除技術的應用

2.1 動物模型的構建

基因敲除動物是指利用基因敲除技術和胚胎干細胞技術制備的某一特定位點基因缺失的動物[8]。隨著技術不斷更新，CRISPR/Cas9基因敲除技術日趨成熟，為動物領域研究提供便利。

馬友才等[9]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建PDE5基因敲除模型并進行表型鑒定，研究PDE5基因在相關疾病中的生理機制，為一些疾病的治療及靶向藥物的開發利用提供新思路。黃思嘉等[10]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統精確編輯雞AMHR2基因。魯國濤[11]利用CRISPR/Cpf1系統編輯雞DF-1細胞，為揭示DDX21基因的功能及致病機理奠定基礎。CRISPR/Cas9基因編輯技術在人類細胞中同樣適用，鐮刀型細胞貧血癥也稱為地中海貧血癥，有研究者利用Cas9編輯技術修飾sgRNA-RNP，進而編輯造血干/祖細胞（HSPCs）中的HBG1/2啟動子，實現對β-地中海貧血患者源性熱休克細胞編輯[12]。

利用CRISPR/Cas9系統構建動物模型是較常見的操作方法。Ding等[13]利用CRISPR/Cas9系統，運用顯微注射法將CassnRNA和sgRNAs注射到單細胞期胚胎中，成功地實現綿羊MSTN基因的精確基因編輯，結果顯示，MSTN基因敲除綿羊可以作為理想動物模型。龐米米等[14]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建TLR9基因敲除鼠動物模型，研究表明，通過該技術成功構建TLR9基因敲除動物模型，為研究TLR9基因功能和分子機制提供理想模型。張世陽等[15]通過CRISPR/Cas9系統成功地獲得Spag6基因編輯的突變體，為進一步探討斑馬魚Spag6基因的體內功能奠定基礎。

CRISPR/Cas9基因編輯技術在人類疾病研究中被廣泛使用。Shalem等[16]使用慢病毒轉染人細胞構建CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文庫，篩選出目標基因，進行基因編輯，最終證明Cas9具有廣闊的應用前景。Platt等[17]為使Cas9在體內得到廣泛的應用，建立一個Cre依賴的Cas9敲除小鼠，用于癌癥動物模型。

2.2 細胞系的構建

伴隨分子細胞水平研究的深入，許多難以傳代的細胞嚴重影響試驗進度，影響后續試驗的順利開展。因此，構建細胞系迫在眉睫。構建細胞系的方法有多種，而CRISPR/Cas9是其中之一。孫謹等[18]利用CRISPR/Cas9基因敲除系統，構建IL-12p35基因C6細胞系，為膠質腫瘤細胞的發生提供理論依據。有研究表明，利用該技術手段介導豬相關細胞，成功構建細胞系[19]。張紅等[20]利用CRISPR/Cas9技術成功構建FSTL1基因敲除的SiHa細胞穩定株。李浩可等[21]利用CRISPR/Cas9技術構建穩定敲除Lrtm1基因的C2C12細胞系，為研究Lrtm1基因的作用提供試驗基礎。這些細胞系的構建為試驗研究提供基礎資料。

2.3 微生物的構建

CRISPR/Cas9為細菌和古細菌抗噬菌和質粒提供分子免疫。蔣成輝等[22]利用CRISPR/Cas9基因敲除技術成功構建耐甲氧西林金黃色葡萄球USA300菌株，闡明金黃色葡萄球菌的作用機理。楊行堂等[23]運用基因敲除技術建立幽門螺旋桿菌感染的C57BL基因小鼠模型，為相關研究提供理論依據。CRISPR/Cas是一種微生物適應性免疫系統，使用RNA引導的核酸酶切割外來遺傳元素[24-26]。3種類型的CRISPR系統（I-III）已經在廣泛的細菌和古細菌宿主中被鑒定出來，其中每個系統包括一組CRISPR相關（Cas）基因、非編碼RNA和一系列獨特的重復元素（直接重復）。這些重復序列由短的可變序列組成[27]，來自稱為原間隔區的外源DNA靶點，一起構成CRISPR RNA（crRNA）陣列。在DNA靶區內，每個原間隔區總是與一個原間隔區相鄰基序（PAM）相關聯，而PAM的變化取決于特定的CRISPR系統[28-30]。

3 展望

通過基因敲除技術逐漸明確大量模式生物和重要功能微生物的全基因組，并能準確定位功能基因，從基因水平上更加清楚地認識微生物的代謝規律。同時，敲除載體及相關技術的完善可進一步推動微生物代謝工程的廣泛應用，通過基因敲除手段改變微生物細胞的代謝流向，阻斷有害代謝產物積累，有望降低成本，大幅度提高生產水平及產品純度。

近年來，由于抗生素濫用，多種常見病均出現耐藥性，因此可以嘗試從功能基因角度研究耐藥基因，利用CRISPR/Cas9基因敲除技術，敲除相應基因，進而探討耐藥機制，并開發研制抑制耐藥性、增強抗菌的藥物，也可研制具有預防和治療作用的功能性食品。利用基因敲除技術敲除調控腫瘤的相關基因，或抑制腫瘤的生長或促進腫瘤細胞凋亡，從而達到治療腫瘤的目的。基因敲除技術可以研究基因結構和功能，可應用于調控細胞周期、疫苗的研發與制備等領域。由此可見，基因敲除技術具有廣闊的發展前景。