LC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中蘆薈苦素濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究

譚銀豐 孫墨簫 張蕾 楊雯悅 李海龍 李友賓

中圖分類(lèi)號(hào) R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）22-2701-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.03

摘 要 目的：建立測(cè)定大鼠血漿中蘆薈苦素濃度的方法，并考察蘆薈苦素的藥動(dòng)學(xué)特征。方法：血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，以蘆薈新苷D為內(nèi)標(biāo)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大鼠血漿中蘆薈苦素的血藥濃度。以Synergi Hydro-RP為色譜柱，以0.1‰甲酸溶液-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.50 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 ?L;采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行負(fù)離子檢測(cè)，用于定量分析的離子對(duì)分別為m/z 393.1→272.9（蘆薈苦素）、m/z 555.3→144.9（內(nèi)標(biāo)）。采用上述方法測(cè)定大鼠尾靜脈注射（3.35 mg/kg）和灌胃（16.75 mg/kg）蘆薈苦素后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2.5、4、6、8、10 h靜脈血中蘆薈苦素的質(zhì)量濃度，采用DAS 3.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：蘆薈苦素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為1～600 ng/mL（r=0.994 5），定量下限為1 ng/mL，批內(nèi)、批間RSD均小于15%，批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度在±15%內(nèi)，基質(zhì)因子為（92.74±4.33）%～（94.84±2.57）%，提取回收率為（69.04±2.13）%～（75.03±2.84）%，穩(wěn)定性試驗(yàn)的實(shí)測(cè)結(jié)果與理論值的偏差在±15%內(nèi)。大鼠靜脈注射和灌胃蘆薈苦素后，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)cmax分別為（10 693.3±2 745.3）、（223.3±36.2） ng/mL，t1/2分別為（2.45±1.45）、（3.33±1.91） h，AUC0-24 h分別為（4 190.6±883.6）、（1 210.1±93.9） ng·h/mL（n=3），口服絕對(duì)生物利用度為11.13%。結(jié)論：本研究成功建立了一種快速、靈敏的蘆薈苦素血藥濃度測(cè)定方法，適用于其藥動(dòng)學(xué)研究。

關(guān)鍵詞 蘆薈苦素;蘆薈新苷D;血藥濃度;藥動(dòng)學(xué);液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;大鼠

Determination of Aloesin in Rat Plasma by LC-MS/MS and Its Pharmacokinetic Study

TAN Yinfeng，SUN Moxiao，ZHANG Lei，YANG Wenyue，LI Hailong，LI Youbin（School of Pharmacy， Hainan Medical University/Hainan Provincial Key Laboratory for Research and Development of Tropical Herbs/Haikou Key Laboratory of Li Nationality Medicine， Haikou 571159， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the determination of aloesin in plasma of rats， and to investigate pharmacokinetic characteristics of aloesin. METHODS： The plasma samples were precipitated with methanol. Using aloeresin D as internal standard， the plasma concentration of aloesin was determined by LC-MS/MS. The determination was performed on Synergi Hydro-RP column with mobile phase consisted of 0.1‰ formic acid-methanol （gradient elution） at the flow rate of 0.50 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 5 ?L. The electrospray ionization source was applied to carry out negative ion detection with multiple reaction monitoring mode. The ion transitions for quantitative analysis were m/z 393.1→272.9 （aloesin） and m/z 555.3→144.9 （internal standard）， respectively. The concentration of aloesin in venous blood was determined by above method at 0.083， 0.167， 0.333， 0.667， 1， 1.5， 2.5， 4， 6， 8， 10 h after intravenous injection （3.35 mg/kg） and intragastric administration （16.75 mg/kg） of aloesin. DAS 3.0 software was used to calculate pharmacokinetic parameters.? RESULTS： The linear range of aloesin were 1-600 ng/mL （r=0.994 5）. The lower limit of quantification was 1 ng/mL， and RSDs of within and between batches were less than 15%; accuracies within and between batches were within ±15%. The matrix factors were （92.74±4.33）%-（94.84±2.57）%， and extraction recoveries were （69.04±2.13）%-（75.03±2.84）%; the deviation between the measured results of the stability test and the theoretical values were within±15%. After intravenous injection and intragastric administration of aloesin， main pharmacokinetic parameters were as follows： cmax were （10 693.3±2 745.3） and （223.3±36.2） ng/mL; t1/2 were （2.45±1.45） and （3.33±1.91） h; AUC0-24 h were （4 190.6±883.6） and （1 210.1±93.9） ng·h/mL （n=3）. Absolute bioavailabi- lity was 11.13%. CONCLUSIONS： The established method is rapid and sensitive for plasma determination of? aloesin， and suitable for its pharmacokinetic study.

KEYWORDS? ?Aloesin; Aloeresin D; Plasma concentration; Pharmacokinetics; LC-MS/MS; Rats

蘆薈苦素是一種色酮苷類(lèi)物質(zhì)，存在于多種百合科蘆薈屬植物中，在蘆薈中的含量約為3‰[1]。蘆薈為百合科植物庫(kù)拉索蘆薈Aloe barbadensis Miller、好望角蘆薈Aloe ferox Miller或其他同屬近緣植物葉的汁液濃縮干燥物，具有瀉下通便、清肝瀉火、殺蟲(chóng)療疳之功效[2-3]。相關(guān)研究顯示，蘆薈苦素是蘆薈的重要活性物質(zhì)之一[4-5]，其主要功效如下：（1）抑制酪氨酸酶活性，阻止黑色素的合成，具有美白功效[6];（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子和生長(zhǎng)因子的釋放，具有抗炎作用[7];（3）誘導(dǎo)Sam蛋白、Mad蛋白及其類(lèi)似蛋白（Smad）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活，促進(jìn)傷口愈合[7];（4）激活Wnt信號(hào)通路，下調(diào)Notch信號(hào)通路，調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)功能，改善結(jié)腸炎模型大鼠的病理狀態(tài)[8-9];（5）促進(jìn)脂聯(lián)素分泌，調(diào)節(jié)糖脂代謝，具有抗糖尿病作用[10]。毒理學(xué)研究表明，蘆薈苦素基本無(wú)毒副作用[11]。藥動(dòng)學(xué)屬性是評(píng)估活性化合物成藥性的重要指標(biāo)，然而，針對(duì)蘆薈苦素的藥動(dòng)學(xué)研究很少，有關(guān)報(bào)道僅采用二維液相色譜法測(cè)定了蘆薈苦素的含量，并沒(méi)有提供其具體的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，所用分析技術(shù)相對(duì)落后且操作繁瑣[12]。本文擬采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測(cè)定大鼠血漿中蘆薈苦素的濃度，并考察其藥動(dòng)學(xué)特征，為蘆薈苦素的成藥性研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Nexera XR型超高效液相色譜（UHPLC）儀（日本Shimadzu公司）、AB-SCIEX API 4000+型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀及配備的Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)Applied Biosystem公司）、5922型冷凍離心機(jī)（日本Kubota公司）、XS105DU型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、LabTower EDI15型超純水一體機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、Vibrax型圓周振蕩器（德國(guó)Ika公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

蘆薈苦素對(duì)照品（批號(hào)20190530，純度≥98%）購(gòu)自昊睿化學(xué)（上海）有限公司;蘆薈新苷D對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)19072605，純度≥98%）購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;異氟烷（批號(hào)2018/08）購(gòu)自北京吉安得爾科技有限公司;甲醇（色譜級(jí)）購(gòu)自德國(guó)Merck公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為7周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠，共6只，體質(zhì)量為243～300 g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2014-0011。所有大鼠均在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度40%～70%、12 h明暗交替的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

以Synergi Hydro-RP（2.10 mm×50 mm，4 ?m）為色譜柱，以0.1‰甲酸溶液（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～0.50 min，5%B;0.51～3.00 min，5%B→90%B;3.01～4.00 min，90%B;4.01～5.00 min，5%B）;流速為0.50 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為5 ?L。采用電噴霧離子源（ESI），以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行負(fù)離子檢測(cè);噴霧電壓為4 500 V;離子源氣體1（氮?dú)猓毫?0 psi;離子源氣體2（氮?dú)猓毫?0 psi;氣簾氣（氮?dú)猓毫?0 psi;噴霧溫度為550 ℃;碰撞氣壓力為2 psi。蘆薈苦素及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，二級(jí)質(zhì)譜圖及化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 蘆薈苦素貯備液 取蘆薈苦素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解、稀釋?zhuān)瞥少|(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的貯備液，于4 ℃下保存，備用。臨用時(shí)，用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度即可。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解、稀釋?zhuān)瞥少|(zhì)量濃度為50 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃下保存，備用。

2.3 血漿樣品的處理

取血漿樣品50 ?L，置于離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液150 ?L，以2 000 r/min渦旋10 min，充分沉淀蛋白，再于4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，取上清液置于微量進(jìn)樣管中，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.4 方法學(xué)考察

按2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的要求，進(jìn)行方法學(xué)考察[13]。

2.4.1 專(zhuān)屬性考察 取不同來(lái)源的大鼠空白血漿、空白血漿+蘆薈苦素（1 ng/mL）、靜脈注射給藥8 h時(shí)經(jīng)眼眶靜脈采集到的大鼠血漿樣品、灌胃給藥8 h時(shí)經(jīng)眼眶靜脈采集到的大鼠血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理（空白血漿不加內(nèi)標(biāo)）后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖2）。結(jié)果顯示，蘆薈苦素、內(nèi)標(biāo)的出峰時(shí)間分別約為1.85、2.67 min，分離效果良好，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，表明本方法專(zhuān)屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系與定量下限考察 取空白血漿，分別加入0.1 mg/mL的蘆薈苦素貯備液適量，配制成質(zhì)量濃度分別為600、400、200、40、10、2、1 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比（y）為縱坐標(biāo)、待測(cè)物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/x2）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.006 17x+0.001 13（r=0.994 5）。結(jié)果顯示，蘆薈苦素在1～600 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系，定量下限為1 ng/mL。

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn) 取空白血漿，分別加入0.1 mg/mL的蘆薈苦素貯備液適量，配制成定量下限質(zhì)量濃度（1 ng/mL）和低、中、高質(zhì)量濃度（3、50、500 ng/mL）的質(zhì)控血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，根據(jù)隨行回歸方程計(jì)算實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度。每個(gè)質(zhì)量濃度平行分析5個(gè)樣品，考察批內(nèi)精密度[以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）表示，下同]和批內(nèi)準(zhǔn)確度[以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度的均值與理論質(zhì)量濃度的相對(duì)誤差（RE）表示，下同];于3 d內(nèi)分析3個(gè)分析批，考察批間精密度和批間準(zhǔn)確度。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.4 殘留效應(yīng)考察 取“2.4.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍上限的血漿樣品（蘆薈苦素質(zhì)量濃度為600 ng/mL）適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析;隨后取空白血漿樣品適量，不加內(nèi)標(biāo)，同法處理后進(jìn)樣分析，考察殘留效應(yīng)。結(jié)果顯示，蘆薈苦素的殘留峰面積小于定量下限質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品蘆薈苦素峰面積的20%，內(nèi)標(biāo)的殘留峰面積小于上述質(zhì)控血漿樣品內(nèi)標(biāo)峰面積的5%，表明本方法殘留效應(yīng)符合要求[13]。

2.4.5 稀釋可靠性考察 用空白血漿配制蘆薈苦素質(zhì)量濃度為15 000 ng/mL的稀釋質(zhì)控樣品，再用空白血漿稀釋30倍（稀釋后的理論質(zhì)量濃度為500 ng/mL）后，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，考察稀釋可靠性。共平行分析5個(gè)樣品。結(jié)果顯示，經(jīng)稀釋后質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度（RE）在±15%內(nèi)。

2.4.6 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率試驗(yàn) 按文獻(xiàn)[14-15]方法考察基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率。取不同來(lái)源的大鼠空白血漿適量，按“2.4.3”項(xiàng)下方法配制蘆薈苦素低、中、高質(zhì)量濃度（3、50、500 ng/mL）的質(zhì)控血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積A1（以內(nèi)標(biāo)峰面積進(jìn)行歸一化處理，下同）。用甲醇配制蘆薈苦素和內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度與前者對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積A2。取按“2.3”項(xiàng)下方法處理后的大鼠空白血漿適量，配制蘆薈苦素和內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度與前者對(duì)應(yīng)的血漿樣品，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積A3。每個(gè)質(zhì)量濃度平行分析5個(gè)樣品，并按如下公式計(jì)算基質(zhì)因子和提取回收率，基質(zhì)因子=A3/A2×100%，提取回收率=A1/A3×100%。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.7 穩(wěn)定性考察 取空白血漿適量，按“2.4.3”項(xiàng)下方法配制蘆薈苦素低、中、高質(zhì)量濃度（3、50、500 ng/mL）的質(zhì)控血漿樣品，分別考察樣品在下列情況下存放的穩(wěn)定性：①樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理后放置于自動(dòng)進(jìn)樣器（25 ℃）中8 h，進(jìn)樣分析;②樣品經(jīng)反復(fù)凍融（-20～25 ℃）3次后再同法處理，進(jìn)樣分析;③樣品在室溫下放置4 h后再同法處理，進(jìn)樣分析;④樣品在-20 ℃下存放15 d后再同法處理，進(jìn)樣分析。每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備20份，每種情況各5份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法計(jì)算RE。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

取SD大鼠6只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，并于給藥前禁食不禁水12 h。取3只大鼠經(jīng)尾靜脈注射蘆薈苦素3.35 mg/kg（溶劑為生理鹽水），另取3只大鼠灌胃蘆薈苦素16.75 mg/kg（溶劑為生理鹽水），劑量參考文獻(xiàn)[12]并結(jié)合檢測(cè)方法的定量下限設(shè)置。分別于給藥后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2.5、4、6、8、10 h經(jīng)眼眶靜脈采血約0.1 mL，置于預(yù)先用肝素鈉溶液潤(rùn)洗的離心管中，以4 000 r/min離心10 min，取血漿于-80 ℃下保存。在定量分析時(shí)，用空白血漿將上述血漿樣品稀釋至蘆薈苦素線性范圍內(nèi)，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，根據(jù)隨行回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度。采用DAS 3.0軟件繪制藥-時(shí)曲線，并計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，給藥8 h后，靜脈注射或灌胃給藥大鼠血漿中蘆薈苦素的質(zhì)量濃度均低于定量下限（1 ng/mL），蘆薈苦素在大鼠體內(nèi)的口服絕對(duì)生物利用度[（灌胃AUC0-∞×靜脈注射劑量）/（靜脈注射AUC0-∞×灌胃劑量）×100%）為11.13%，詳見(jiàn)圖3（給藥8 h后的數(shù)據(jù)略）、表5。

3 討論

蘆薈苦素是極性較大的化合物，易溶于水，在開(kāi)發(fā)LC-MS/MS定量分析方法的過(guò)程中，筆者曾使用Kinetex XB-C18（2.10 mm×50 mm，2.6 ?m）進(jìn)行分離，結(jié)果顯示，蘆薈苦素在0.5 min左右即出峰，且色譜峰峰形較差。經(jīng)過(guò)篩選，筆者改用對(duì)極性化合物有更好分離效果的Synergi Hydro-RP（2.10 mm×50 mm，4 ?m）進(jìn)行分離，結(jié)果顯示，蘆薈苦素的分離效果較好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

本研究前期使用了葒草苷作為蘆薈苦素定量分析的內(nèi)標(biāo)化合物，因?yàn)樵摮煞峙c蘆薈苦素都是碳苷，結(jié)構(gòu)差異主要在于葒草苷苷元是黃酮。然而，葒草苷的極性比蘆薈苦素小，在甲醇中的溶解度低于1 mg/mL，色譜峰拖尾嚴(yán)重，筆者通過(guò)在流動(dòng)相中加入甲酸以改善峰形，卻導(dǎo)致蘆薈苦素出現(xiàn)前延峰，表明葒草苷不適合用作蘆薈苦素定量分析的內(nèi)標(biāo)化合物。經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，蘆薈新苷D和蘆薈苦素都是從蘆薈中分離得到的色酮苷類(lèi)化合物，且化學(xué)性質(zhì)相近[1]。本研究結(jié)果表明，蘆薈新苷D適宜用作蘆薈苦素定量分析的內(nèi)標(biāo)化合物。

本研究通過(guò)LC-MS/MS法測(cè)定不用給藥方式下大鼠血漿中蘆薈苦素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，蘆薈苦素在大鼠體內(nèi)的口服絕對(duì)生物利用度為11.13%。由此推測(cè)，蘆薈苦素的親水性分子結(jié)構(gòu)可能阻礙了其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，減少了其體內(nèi)吸收，提示在蘆薈苦素的后續(xù)藥物研發(fā)中應(yīng)通過(guò)結(jié)構(gòu)改造、制劑研究或其他方法來(lái)提升其有效血藥濃度，提高其生物利用度。

綜上所述，本研究成功建立了一種快速、靈敏的蘆薈苦素血藥濃度測(cè)定方法，并適用于該化合物的藥動(dòng)學(xué)研究。

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（收稿日期：2021-07-01 修回日期：2021-10-09）

（編輯：鄒麗娟）