UHPLC法結合超濾法測定連錢草中3種成分的血漿蛋白結合率

陳偉康 劉德鴻 熊明朋 袁惠 周國平

中圖分類號 R969.1;R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）22-2720-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.06

摘 要 目的：建立測定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸血漿蛋白結合率的方法。方法：采用超高效液相色譜法結合超濾法測定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸在新西蘭兔體內的血漿蛋白結合率。以Phenomenex Luna? C18為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫為45 ℃，檢測波長為327 nm，進樣量為3 μL。結果：在低、中、高質量濃度下，迷迭香酸的血漿蛋白結合率分別為（97.78±1.67）%、（94.32±1.42）%、（95.12±1.51）%（n=3），咖啡酸的血漿蛋白結合率分別為（90.12±2.33）%、（89.53±1.98）%、（90.23±1.56）%（n=3），綠原酸的血漿蛋白結合率分別為（63.23±2.12）%、（67.87±1.06）%、（62.34±1.34）%（n=3）。結論：所建方法操作簡單、分析時間較短，可用于測定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的血漿蛋白結合率。

關鍵詞 連錢草;迷迭香酸;咖啡酸;綠原酸;血漿蛋白結合率;超高效液相色譜;超濾法;兔

Determination of Plasma Protein Binding Rate of 3 Components from Glechoma longituba by UHPLC Combined with Ultrafiltration

CHEN Weikang，LIU Dehong，XIONG Mingpeng，YUAN Hui，ZHOU Guoping（Jiangxi Institute for Drug Control/NMPA Key Laboratory of Quality Evaluation of Chinese Patent Medicine/Jiangxi Province Engineering Research Center of Drug and Medical Device Quality， Nanchang 330029， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the determination of plasma protein binding rate of rosmarinic acid， caffeic acid and chlorogenic acid from Glechoma longituba. METHODS： UHPLC method combined with ultrafiltration method was adopted to determine the plasma protein binding rate of rosmarinic acid， caffeic acid and chlorogenic acid from G. longituba in the plasma of New Zealand rabbits. The determination was performed on a Phenomenex Luna? C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （A）-0.1% formic acid solution （B） （gradient elution） at the flow rate of 0.5 mL/min. The column temperature was set at 45 ℃， and the detection wavelength was 327 nm. The sample size was 3 μL. RESULTS： At low， medium and high concentrations， the plasma binding rates of rosmarinic acid were （97.78±1.67）%， （94.32±1.42）%， （95.12±1.51）%， respectively （n=3）; those of caffeic acid were （90.12±2.33） %， （89.53±1.98）%，（90.23±1.56）%， respectively （n=3）; those of chlorogenic acid were （63.23±2.12）%， （67.87±1.06）%， （62.34±1.34）%， respectively （n=3）.? CONCLUSIONS： Established method is easy to operate and shorter time for analysis. It can be used to determine the plasma protein binding rate of rosmarinic acid， caffeic acid and chlorogenic acid in G. longituba.

KEYWORDS? ?Glechoma longituba; Chlorogenic acid; Caffeic acid; Rosmarinic acid; Plasma protein binding rate; UHPLC; Ultrafitration; Rabbit

連錢草又名活血丹、鈸兒草、佛耳草，為唇形科植物活血丹Glechoma longituba（Nakai）Kupr.的干燥地上部分[1]。該藥材具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫的作用，被臨床廣泛用于治療熱淋、石淋、濕熱黃疸、瘡癰腫痛、跌打損傷等癥[2]?，F有研究顯示，連錢草的化學成分眾多，主要包括有機酸類、黃酮類、萜類和揮發油類等，其中有機酸類成分含量以迷迭香酸最高，其次為咖啡酸、綠原酸[3]。上述3種有機酸類成分具有抗炎、抗病毒、治療膽汁淤積等作用，為連錢草治療肝炎、黃疸的主要成分[4-10]。目前關于迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的藥理學研究較多，但同時測定三者血漿蛋白結合率的相關研究較少。血漿蛋白結合率是藥物進入人體后，與血漿中白蛋白結合的藥物量占全部藥物總量的百分比，是藥動學的重要參數之一。藥物與血漿蛋白的結合將直接影響體內游離藥物的濃度，從而影響藥物的吸收、分布、代謝和消除，最終影響其藥效學行為[11]。本研究擬采用超高效液相色譜（UHPLC）法結合超濾法測定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸在新西蘭兔體內的血漿蛋白結合率，為闡明該藥材中有效成分的血漿蛋白結合特性提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1290 InfinityTM型UHPLC儀及配備的二元高壓梯度泵、柱溫箱、自動進樣器、二極管陣列檢測器、ChemStation C.01.03工作站（美國Agilent公司），Milli-Q Direct16型超純水儀（美國Millipore公司），Amicon Ultra-0.5 10K型超濾離心管（截留分子量10 000 Da，德國Merck公司），Micro 17型臺式高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），Vortex WX型渦旋混合器（意大利VELP公司），Transferpette S型微量移液器（德國Brand公司），BP225D型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]，HH-6型數顯恒溫水浴鍋[國華（常州）儀器制造有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

連錢草采自江西省九江市，經江西省藥品檢驗檢測研究院周國平主任中藥師鑒定為唇形科植物活血丹G. longituba（Nakai）Kupr.的干燥地上部分;迷迭香酸對照品（批號111871-202007，純度98.1%）、咖啡酸對照品（批號110885-200102，純度>99.9%）、綠原酸對照品（批號110753-202018，純度96.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈（色譜純）購自美國Sigma-Aldrich公司;甲酸（色譜純）購自美國TEDIA公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為超純水。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為普通級新西蘭兔，雌雄各半，體質量為2.5～3.0 kg，購自贛州市畜牧研究所，實驗動物生產許可證號為SCXK（贛）2018-0009。本研究方案符合動物實驗的相關倫理要求。

2 方法

2.1 血漿采集

取新西蘭兔耳動脈血，置于肝素鈉一次性采血管中，以1 000×g離心3 min，取上清液，即得血漿，于-18 ℃下冷凍，備用。

2.2 磷酸鹽緩沖液的配制

分別稱取氯化鈉8.00 g、氯化鉀0.20 g、磷酸氫二鈉1.44 g、磷酸二氫鉀0.24 g，置于1 000 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.5%氫氧化鈉溶液調pH為7.4，即得磷酸鹽緩沖液（PBS）。

2.3 混合對照品系列溶液和混合質控樣品的配制

分別稱取迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸對照品各10.0 mg，加70%甲醇溶解并稀釋，制成上述成分質量濃度均為1 mg/mL的混合對照品貯備液。精密吸取上述混合對照品貯備液適量，加入兔空白血漿超濾液稀釋，制成質量濃度分別為1、3、10、25、50、100、200、300、400 μg/mL的混合對照品系列溶液。另精密吸取上述混合對照品貯備液適量，加入兔空白血漿稀釋，制成質量濃度分別為1、3、50、300 μg/mL的混合質控樣品。

2.4 供試品溶液的配制

取連錢草藥材，粉碎，過四號篩，精密稱取粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入PBS 20 mL，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，濾過，即得連錢草提取液（參考文獻[12]采用高效液相色譜法測定，迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質量濃度分別為261.3、155.3、72.5 μg/mL），作為高質量濃度的供試品溶液。精密吸取上述提取液3、4 mL，分別置于5 mL量瓶中，加PBS稀釋至刻度，搖勻，分別作為低、中質量濃度的供試品溶液（低質量濃度的供試品溶液中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質量濃度分別為156.8、93.2、43.5 μg/mL，中質量濃度的供試品溶液中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質量濃度分別為209.0、124.2、58.0 μg/mL）。

2.5 色譜條件

以Phenomenex Luna? C18（150 mm×2 mm，3 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～1.0 min，5%A;1.0～20.0 min，5%A→21%A）;流速為0.5 mL/min;柱溫為45 ℃;檢測波長為327 nm;進樣量為3 μL。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性試驗 取混合對照品溶液（溶劑為70%甲醇，迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質量濃度分別為185.0、224.2、156.0 μg/mL）、“2.7”項下中質量濃度供試品+兔血漿的超濾液樣品、PBS+兔血漿的超濾液樣品（即空白樣品）各適量，按“2.5”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸色譜峰的分離度良好，內源性物質對測定無干擾，表明本方法專屬性良好。兔血漿中迷迭香酸等3種成分定量分析的超高效液相色譜圖見圖1。

2.6.2 線性關系和定量下限考察 取“2.3”項下混合對照品系列溶液，于37 ℃水浴中孵育40 min，取孵育液0.5 mL轉移至超濾離心管中，以14 000×g離心10 min，取超濾液按“2.5”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測物的質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，分別擬合迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的回歸方程，并以線性范圍下限作為待測物的定量下限。兔血漿中迷迭香酸等3種成分定量分析的回歸方程、線性范圍和定量下限考察結果見表1。

2.6.3 精密度與準確度試驗 取“2.3”項下定量下限質量濃度（1 μg/mL）以及低、中、高質量濃度（3、50、300 μg/mL）的混合質控樣品適量，于37 ℃水浴中孵育40 min，取孵育液0.5 mL轉移至超濾離心管中，以14 000×g離心10 min，取超濾液按“2.5”項下色譜條件連續進樣6次，考察日內精密度;連續測定3 d，考察日間精密度。以實測質量濃度與理論質量濃度的相對誤差（RE）來考察準確度。兔血漿中迷迭香酸等3種成分定量分析的精密度與準確度試驗結果見表2。

2.6.4 穩定性試驗 取“2.3”項下低、中、高質量濃度（3、50、300 μg/mL）的混合質控樣品各9份，于37 ℃水浴中孵育40 min，取孵育液0.5 mL轉移至超濾離心管中，以14 000×g離心10 min，取超濾液，分別置于4 ℃下冷藏24 h、室溫下放置12 h、反復凍融（-20～25 ℃）3次后，按“2.5”項下色譜條件進樣分析，考察穩定性。結果顯示，上述條件下迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸峰面積的RSD均小于10%，表明各混合質控樣品在上述條件下的穩定性良好。

2.7 血漿蛋白結合率的測定

精密吸取“2.4”項下低、中、高質量濃度的供試品溶液各200 μL，分別置于2 mL離心管中，加入兔血漿300 μL，渦旋30 s使混合均勻，于37 ℃水浴中孵育40 min，取孵育液0.5 mL轉移至超濾離心管中，以14 000×g離心10 min，取超濾液按“2.5”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，代入隨行回歸方程計算超濾液中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的質量濃度，并根據下列公式計算血漿蛋白結合率：血漿蛋白結合率（%）=（供試品溶液中待測物的質量濃度-超濾液中待測物的質量濃度）/供試品溶液中待測物的質量濃度×100%。每個質量濃度平行操作3份。連錢草中迷迭香酸等3種成分的兔血漿蛋白結合率測定結果見表3。

3 討論

迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸均為酚酸類化合物，其最大吸收波長分別為329、323、327 nm[13-15]。三者最大吸收波長相近，經本課題組前期研究證實，無論選擇上述任意波長對3種成分檢測的靈敏度影響均不大，因綠原酸的最大吸收波長在三者中間，因此選擇327 nm作為本研究的檢測波長。

本課題組前期比較了等度洗脫和梯度洗脫對迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸色譜峰的影響，結果顯示，梯度洗脫在分離效果和分析時間方面均優于等度洗脫，故選擇梯度洗脫。此外，本研究采用UHPLC儀，其洗脫梯度變化不宜過快、分析時間不宜過短，因為洗脫梯度變化過快或分析時間過短可使咖啡酸的色譜峰與其他雜質色譜峰重合，大大影響定量分析的準確性。

本課題組前期比較了不同柱溫（25、35、45 ℃）對迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸色譜峰分離的影響，結果顯示，柱溫對三者色譜峰分離度的影響并不顯著，但當柱溫為45 ℃時，三者的分析時間明顯縮短且柱壓更低，因此選擇45 ℃作為定量分析的柱溫。

本研究采用德國Merck公司Amicon Ultra-0.5 10K型超濾離心管，其能在高速離心的狀態下于較短的時間（10～30 min）內截留分子量大于10 000 Da且與血漿蛋白結合的化學成分，而小分子化學成分則可通過超濾膜，從而實現樣品的快速前處理。常用的平衡透析半透膜法則需要12～48 h才能完成小分子成分與大分子成分的分離，同時還存在操作復雜、消耗樣品量大、不穩定成分易變質等不足[16]。與平衡透析半透膜法比較，超濾法分析時間短、操作簡單，因此本研究選擇超濾法作為血漿樣品處理方法。

血漿蛋白結合率測定結果顯示，連錢草中迷迭香酸、咖啡酸的血漿蛋白結合率較高（>80%），推測連錢草與其他藥物聯用時，可能通過競爭性結合血漿蛋白，抑制其他藥物與血漿蛋白的結合，使其他藥物在血液中的濃度升高。

綜上所述，本研究所建方法操作簡單、分析時間較短，可用于測定連錢草中迷迭香酸、咖啡酸、綠原酸的血漿蛋白結合率。

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（收稿日期：2021-07-10 修回日期：2021-10-22）

（編輯：鄒麗娟）