越婢加術湯的HPLC指紋圖譜建立、含量測定及化學模式識別分析

趙峰 高太祥 石莉堯 王瑞

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）22-2724-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.07

摘 要 目的：建立越婢加術湯的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，測定其中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量，同時進行化學模式識別分析。方法：以甘草酸銨為參照，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》建立10批越婢加術湯的HPLC指紋圖譜并進行相似度評價，結合混合對照品指認共有峰;采用HPLC法測定鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量;采用SPSS 26.0軟件進行聚類分析，采用SIMCA 13.0軟件進行主成分分析和偏最小二乘法-判別分析，并篩選影響越婢加術湯質量的差異性成分。結果：越婢加術湯指紋圖譜中共有20個共有峰，與對照指紋圖譜的相似度均大于0.92;共指認了2個色譜峰，分別為甘草苷（峰11）和甘草酸銨（峰18）。鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿檢測質量濃度的線性范圍分別為0.98～48 μg/mL（r=0.999 9）、1.02～51 μg/mL（r=0.999 2）;精密度、重復性、穩定性（24 h）試驗的RSD均小于2%;平均加樣回收率分別為105.67%（RSD=2.88%，n=9）、104.15%（RSD=2.02%，n=9）;含量分別為0.008 1～0.014 3、0.002 5～0.011 8 mg/mL。聚類分析結果顯示，10批越婢加術湯可聚為3類，S1聚為一類，S3聚為一類，S2、S4～S10聚為一類。主成分分析結果顯示，S3位于得分圖的最右側，S1位于得分圖的右側，S2、S4～S10位于得分圖的中部。偏最小二乘法-判別分析結果與聚類分析、主成分分析基本一致，且峰9、峰3、峰12、峰8、峰19、峰18（甘草酸銨）、峰13、峰20、峰11（甘草苷）的重要性投影值均大于1。結論：所建HPLC指紋圖譜和含量測定方法操作簡便、準確，結合化學模式識別可用于越婢加術湯的質量控制。峰9等9個成分為影響越婢加術湯質量的差異性成分。

關鍵詞 越婢加術湯;高效液相色譜法;指紋圖譜;含量測定;化學模式識別

Establishment of HPLC Fingerprints， Content Determination and Chemical Pattern Recognition Analysis of Yuebi Jiazhu Decoction

ZHAO Feng，GAO Taixiang，SHI Liyao，WANG Rui（School of Chinese Medicine and Food Engineering， Shanxi University of TCM， Shanxi Jinzhong 030619， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the HPLC fingerprints of Yuebi jiazhu decoction， determine the contents of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride and carry out chemical pattern recognition analysis. METHODS： Using ammonium glycyrrhizinate as control， HPLC fingerprint of 10 batches of Yuebi jiazhu decoction was established and the similarity was evaluated with Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）， and common peaks were identified in combination with mixed control. HPLC method was used to determine the contents of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride. SPSS 26.0 software was used for cluster analysis; SIMCA 13.0 software was used for principal component analysis and partial least squares discriminant analysis; the differential components affecting the quality were screened. RESULTS： There were 20 common peaks in the fingerprint of Yuebi jiazhu decoction， and the similarities with control fringerprint were all greater than 0.92. Two peaks were identified， which were liquiritin （peak 11） and ammonium glycyrrhizate （peak 18）. The linear range of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride were 0.98-48 μg/mL （r=0.999 9） and 1.02-51 μg/mL （r=0.999 2）， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability tests （24 h） were all less than 2%. The average recoveries were 105.67% （RSD=2.88%， n=9） and 104.15% （RSD=2.02%， n=9）， respectively. The contents of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride were 0.008 1-0.014 3， 0.002 5-0.011 8 mg/mL. Results of cluster analysis showed that among the 10 batches of Yuebi jiazhu decoction， S1 was clustered into one class， S3 was clustered into one class， and S2， S4-S10 were clustered into one class. The results of principal component analysis showed that S3 was located at the far right side of the scoring plot， S1 at the right side of the scoring plot， and S2， S4-S10 at the middle of the scoring plot. The results of partial least squares discriminant analysis were basically consistent with the results of cluster analysis and principal component analysis. The variable importance projection values of peak 9， peak 3， peak 12， peak 8， peak 19， peak 18 （ammonium glycyrrhizinate）， peak 13， peak 20 and peak 11 （liquiritin） were greater than 1. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and the method for content determination are simple and accurate. Combined with chemical pattern recognition， they can be used for the quality control of Yuebi jiazhu decoction. Nine components such as peak 9 are the differential components affecting the quality of Yuebi jiazhu decoction.

KEYWORDS Yuebi jiazhu decoction; HPLC; Fingerprint; Content determination; Chemical pattern recognition

越婢加術湯出自《金匱要略》[1]，由麻黃、石膏、白術、生姜、甘草和大棗等6味藥材組成，常用于風濕熱痹、水腫、腎炎的臨床治療[2-3]。此方中，麻黃解表發汗以消水腫，為君藥;石膏性寒以清滌里熱又牽制麻黃發越過猛，為臣藥;白術健脾利濕并強麻黃利尿消腫之功，為佐藥;再以生姜、大棗、甘草補中和胃并牽制麻黃發汗而耗傷津液[4];諸藥合用，共奏發汗利水、清熱除煩之功[5]。越婢加術湯主要含有生物堿類、黃酮類、揮發油類、三萜類、多糖類等有效成分，其中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿為生物堿類成分，具有止咳平喘、發汗利尿的作用;甘草苷為黃酮類成分，具有抗抑郁、保護心臟和神經等活性;甘草酸銨為齊墩果烷型三萜類成分，具有抗炎、抗病毒、保肝、保護神經等活性[6-10]。由于越婢加術湯的化學成分復雜，加之藥材產地、批次、煎煮方式的不一致，使得煎液質量不穩定，從而導致臨床用藥差異[11]。此外，目前關于越婢加術湯的研究多集中于其臨床應用方面[12-13]，且2020年版《中國藥典》（一部）也未收載該方的質量標準，因此對越婢加術湯進行質量控制就顯得尤為重要。

指紋圖譜具有系統性、整體化的特點，能比較客觀、完整地反映中藥復方中盡可能多的化學成分信息，已被廣泛用于中藥復方的質量控制和評估領域[14-16]。化學模式識別是化學計量學的重要組成部分，包括聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）等，其能通過變換和構造模型，使復雜數據簡單化，最終實現對樣品的分類[17]。基于此，本研究在參考2020年版《中國藥典》（一部）[18]的基礎上，建立了越婢加術湯的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并測定了該方君藥麻黃中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量，同時結合CA、PCA、PLS-DA進行化學模式識別分析，旨在為越婢加術湯的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有2695-2998型HPLC儀及配備的Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）、AB135- S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）、ZDHW型調溫電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）、HC-2518型高速離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）、KQ55200V型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

甘草酸銨對照品（批號53956-04-0，純度94.20%）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司;鹽酸麻黃堿對照品（批號171241-201809，純度100.0%）、鹽酸偽麻黃堿對照品（批號171241-201809，純度99.8%）、甘草苷對照品（批號111610-201607，純度93.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院;732型強酸苯乙烯陽離子交換樹脂（粒徑1 mm，批號C10716501）購自上海麥克林生化科技有限公司;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購自北京百靈威科技有限公司，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

麻黃飲片、白術飲片、石膏飲片、甘草飲片、生姜和大棗經山西中醫藥大學中藥學系裴香萍副教授鑒定，分別為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf的干燥草質莖、菊科植物白術Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖、姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鮮根莖、鼠李科植物棗Ziziphus jujuba Mill.的成熟果實。除生姜、大棗（生姜的產地均為山西，大棗的產地均為河北，均購自山西省晉中市各超市）外，其余飲片均購自山西省晉中市各藥店及診所。10批越婢加術湯中麻黃等4種飲片樣品的來源信息見表1。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 以Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺）（B）為流動相進行梯度洗脫（0～50 min，5%A→17.5%A;50～70 min，17.5%A→35%A;70～85 min，35%A→50%A）;流速為1 mL/min;檢測波長為230 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.1.2 越婢加術湯的制備 由于原方中各飲片用量較大，因此根據各味飲片的常用劑量、配比功效以及前期藥理研究獲得的有效劑量范圍進行調整，得到越婢加術湯的處方比例如下：麻黃9 g、石膏18 g、甘草6 g、大棗15 g、生姜9 g、白術9 g[19-21]。參照越婢加術湯古代煎煮方法，取水600 mL，加入麻黃煮30 min后，納諸藥大火煮沸再小火微沸煮至200 mL，即得越婢加術湯（每升藥液含生藥總量330 g）[1]。同法制得10批（編號為S1～S10）。煎煮時采用相同容器并結合重復性試驗以保證制備過程的一致性。

2.1.3 供試品溶液的制備 取“2.1.2”項下10批越婢加術湯各4 mL，加甲醇6 mL，稱定質量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理20 min，放冷至室溫，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，以14 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 混合對照品溶液的制備 精密稱取甘草苷、甘草酸銨對照品，加甲醇溶解，制得甘草苷、甘草酸銨質量濃度分別為0.02、0.2 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號S1）適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以甘草酸銨為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，20個共有峰相對保留時間的RSD均小于1.5%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.5%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取“2.1.2”項下越婢加術湯（編號S1），共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以甘草酸銨為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，20個共有峰相對保留時間的RSD均小于1.5%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.5%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以甘草酸銨為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，20個共有峰相對保留時間的RSD均小于1.5%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.5%（n=6），表明供試品于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.8 指紋圖譜的建立 取“2.1.2”項下10批越婢加術湯，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將10批越婢加術湯的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行分析，以S1為參照圖譜（該批樣品的色譜信息較多），采用中位數法，設置時間窗寬度為0.1 min，對色譜峰進行多點校正和全峰匹配，得到10批越婢加術湯的疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）。結果顯示，10批越婢加術湯共有20個共有峰，詳見圖1、圖2。

2.1.9 共有峰的指認 經與混合對照品色譜圖[由于甘草苷、甘草酸銨與鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的結構存在差異，無法采用相同的色譜條件進行檢測，因此選擇甘草苷、甘草酸銨為對照。取“2.1.4”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，得到色譜圖（圖3）]比對，共指認了2個共有峰，分別為甘草苷（峰11）、甘草酸銨（峰18）。因甘草酸銨色譜峰峰面積適中、分離度較好，故以甘草酸銨為參照。

2.1.10 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對10批越婢加術湯樣品進行相似度評價。結果顯示，與對照指紋圖譜（R）相比，10批樣品的相似度均大于0.92，表明10批樣品的質量差異較小。結果見表2。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 以Venusil XBP Polar-Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺）（1.5 ∶ 98.5，V/V）為流動相;檢測波長為210 nm;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 將用酸和堿溶液預處理過的陽離子交換樹脂裝入交換柱（直徑2 cm，柱高20 cm），并經酸-堿-酸處理（用1 mol/L稀鹽酸緩慢流過樹脂，用量約為樹脂體積的3倍，再用酸浸泡1 h后，用水沖洗至洗脫液pH為5左右;隨后用1 mol/L氯化鈉緩慢流過樹脂，用量與酸相同，再用堿浸泡1 h后，用水洗至洗脫液pH為9左右;再以上述同樣方法進行酸處理）后轉型為H+型。取“2.1.2”項下越婢加術湯50 mL，用1 mol/L稀鹽酸將越婢加術湯調節pH至1～2后，以每小時1.5倍柱體積流過已轉型的交換柱，并用水沖洗至洗脫液完全無色，再用 2 mol/L氨水100 mL以每小時1.5倍柱體積洗脫，收集氨水洗脫液，于60 ℃水浴中蒸干，殘渣用2 mL甲醇復溶，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 混合對照品溶液 精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品，用甲醇溶解，制得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿質量濃度分別為0.048、0.051 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液 按“2.1.2”項下方法制備缺麻黃的陰性對照藥液，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 系統適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液（編號S1）和陰性對照溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數按鹽酸麻黃堿峰計均大于3 000，陰性對照對兩種成分的測定無干擾。結果見圖4。

2.2.6 線性關系考察 取“2.2.3”項下混合對照品溶液適量，加甲醇釋釋并定容，制得鹽酸麻黃堿質量濃度分別為0.98、2.4、4.8、12、24、48 μg/mL，鹽酸偽麻黃堿質量濃度分別為1.02、2.55、5.1、12.75、25.5、51 μg/mL的混合系列對照品溶液。取上述系列溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、對應峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果顯示，鹽酸麻黃堿的回歸方程為Y=2.0×107X-1 959.1（r=0.999 9），鹽酸偽麻黃堿的回歸方程為Y=1.0×107X-3 263.7（r=0.999 2），表明鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿在各自的質量濃度范圍內與峰面積成良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.3”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為1.37%、1.63%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 取“2.1.2”項下越婢加術湯（編號S1），共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中兩種成分的含量。結果顯示，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量的RSD分別為1.42%、1.79%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.9 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為1.37%、1.21%（n=6），表明供試品于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（編號S1），每份1 mL，共9份，每3份各按已知含量的0.5、1、2倍加入單一對照品溶液（取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品適量，加甲醇溶解并稀釋，制得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿質量濃度分別為0.048、0.051 mg/mL的單一對照品溶液）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的平均加樣回收率分別為105.67%、104.15%，RSD均小于3%（n=9），表明方法準確度良好。結果見表3。

2.2.11 樣品含量測定 按“2.1.2”項下方法制備10批越婢加術湯，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品中兩種成分的含量。每個樣品平行測定3次，結果見表4。

2.3 CA

以10批越婢加術湯HPLC指紋圖譜的20個共有峰峰面積為變量，以平方歐氏距離為測度，采用SPSS 26.0軟件進行CA。結果顯示，當距離為10時，10批樣品可聚為3類，其中S1聚為一類、S3聚為一類，其余聚為一類。這表明10批樣品質量存在一定差異，推測可能與飲片的產地差異相關。結果見圖5。

2.4 PCA

以10批越婢加術湯HPLC指紋圖譜的20個共有峰峰面積建立10×20矩陣，采用SIMCA 13.0軟件進行PCA。結果顯示，S3位于得分圖的最右側，S1位于得分圖的右側，S2、S4～S10位于得分圖的中部，與上述CA結果基本一致。結果見圖6。

2.5 PLS-DA

以10批越婢加術湯HPLC指紋圖譜的20個共有峰峰面積建立10×20矩陣，采用SIMCA 13.0軟件進行PLS- DA。由PLS-DA得分圖可見，在95%置信區間內，10批樣品聚成3類，其中S3位于得分圖的左上側，S1位于左下側，S2、S4～S10位于中部偏右，與上述CA、PCA結果基本一致（圖7）。在PLS-DA載荷圖中，若數據點越偏離原點，表示其對應變量權重越大[22]。結果顯示，20個共有峰中峰9、峰12、峰3、峰19的權重較大（圖8）。

變量重要性投影（VIP）值越大，表明其對分類的貢獻越大，以VIP值>1.0為標準[23]，采用SIMCA 13.0軟件篩選影響越婢加術湯質量的差異性成分。結果顯示，有9個共有峰的VIP值>1，VIP值由大到小依次為峰9>峰3>峰12>峰8>峰19>峰18（甘草酸銨）>峰13>峰20>峰11（甘草苷）。結果見圖9。

3 討論

3.1 色譜條件的確定

3.1.1 指紋圖譜的色譜條件 本課題組前期分別對Waters Atlantis T3（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XSelect HSS T3（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等3種不同類型的C18色譜柱進行了考察，結果發現，采用封尾的Hypersil BDS C18時，所得色譜峰峰形對稱、分離度好且基線平穩，故選擇指紋圖譜的色譜柱為Hypersil BDS C18。同時，本課題組對甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液以及乙腈-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺）等不同流動相體系進行了比較，結果顯示，前3種流動相體系所得色譜峰峰形較差且信息較少，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺）為流動相。此外，本課題組還比較了不同檢測波長（210、230、250、270、290 nm）下的色譜圖，結果顯示，當檢測波長為230 nm時，所得色譜峰數量較多，能較全面、完整地反映越婢加術湯整方的化學成分信息，雖然鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿在該波長條件下均不出峰，暫未能指認這兩種成分，但鑒于中藥指紋圖譜的整體性，故選擇檢測波長為230 nm。

3.1.2 含量測定的色譜條件 本課題組前期分別對Waters Atlantis T3（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XSelect HSS T3（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等3種不同類型的C18色譜柱進行了考察，結果發現，上述C18色譜柱所得鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的色譜峰峰形較差，通過參照2020年版《中國藥典》（一部）“麻黃”項下含量測定的色譜條件，本研究最終選擇了麻黃專用柱（Venusil XBP Polar-Phenyl）[18]。同時，本課題組又對甲醇-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺）、甲醇-0.1%磷酸溶液（含0.1%三乙胺）以及甲醇-0.1%磷酸溶液（含0.2%三乙胺）等不同流動相體系進行了比較，結果發現，以甲醇-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺）為流動相時，所得色譜峰峰形較好。此外，本課題組還比較了不同檢測波長（205、207、210、213、215 nm）下的色譜圖，結果顯示，當檢測波長為210 nm時，柱效更高且峰形更好。

3.2 供試品處理方法的確定

本課題組前期比較了越婢加術湯未經處理、甲醇溶 解未經超聲處理以及甲醇超聲處理等3種方法，結果發現，以甲醇超聲處理后所得樣品色譜圖的雜峰較少，有利于共有峰及待測成分色譜峰的分析與辨認。含量測定供試品處理方法主要包括有機溶劑萃取法、加酸超聲法和陽離子交換樹脂法等[24-25]，本課題組前期參考上述文獻，結果發現，經陽離子交換樹脂法純化后鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿能夠完全分離，所得的色譜峰峰形好。

3.3 測定結果的分析

由于鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿結構的特殊性，無法與其他活性成分在同一波長下被檢出，故為盡可能體現更多成分，在指紋圖譜中暫未指認上述兩種成分。指紋圖譜結果顯示，10批越婢加術湯的HPLC疊加指紋圖譜共有20個共有峰，其與對照指紋圖譜的相似度均大于0.92。經與混合對照品對比，指認峰11為甘草苷，峰18為甘草酸銨。

由于越婢加術湯中活性成分較多，其君藥麻黃中的主要活性成分為鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿[6]，并鑒于2020年版《中國藥典》（一部）中“麻黃”項下含量測定的指標成分為鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿[18]，故選擇這兩種成分為含量測定的指標。含量測定結果顯示，10批越婢加術湯中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量分別為0.008 1～0.014 3、0.002 5～0.011 8 mg/mL，其中S4、S5樣品中上述成分的含量相對較低。由于僅有S4樣品中麻黃飲片的產地為河北，提示河北產麻黃飲片所含有效成分的含量與其他產地樣品存在較大差異;而S5樣品中的各味飲片有與其他批次飲片相同的產地，由此推測相同產地不同批次的麻黃飲片質量也存在差異。

3.4 化學模式識別結果的分析

CA、PCA、PLS-DA結果均顯示，10批越婢加術湯可聚為3類，S1、S3分別為一類，其余為一類。這表明不同產地或相同產地不同批次飲片對越婢加術湯的質量均有影響，其中S3與其余樣品的差異較為明顯，將其所含飲片產地與其余批次進行比較后推測，新疆產甘草與其余產地產甘草的質量存在差異（S3樣品中的各味飲片有與其他批次飲片相同的產地，僅甘草產地為新疆）。有9個共有峰的VIP值>1，分別為峰9、峰3、峰12、峰8、峰19、峰18（甘草酸銨）峰13、峰20、峰11（甘草苷），其中峰9、峰3、峰12、峰8對應成分的VIP值較高，經與各單味飲片的色譜圖比較后發現，上述4個色譜峰均來自麻黃，提示麻黃可能是造成越婢加術湯質量差異的重要因素。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜和含量測定方法操作簡便、準確，結合化學模式識別可用于越婢加術湯的質量控制。峰9等9個成分為影響越婢加術湯質量的差異性成分。

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（收稿日期：2021-05-28 修回日期：2021-10-13）

（編輯：陳 宏）