基于TLR4/NF-κB信號通路探究心脈康改善兔動脈粥樣硬化的機制

周智慧 陳賀 吳錦波 葉小漢

中圖分類號 R972 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）22-2736-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.09

摘 要 目的：探究心脈康改善兔動脈粥樣硬化（AS）的機制。方法：將50只雄性新西蘭兔隨機分為假手術組、模型組、辛伐他汀組[陽性對照，2.60 mg/（kg·d）]和心脈康低、高劑量組[0.21、0.84 g/（kg·d）]，每組10只。假手術組兔給予普通飼料喂養，只分離結扎股動脈但不損傷腹主動脈內皮;其余各組兔均給予高脂飼料喂養并行腹主動脈內膜球囊損傷術以復制AS模型。術后10周，假手術組和模型組兔均灌胃生理鹽水，各藥物組兔灌胃相應藥液（溶劑均為生理鹽水），給藥體積為100 mL，每天給藥1次，連續12周。末次給藥后，觀察各組兔腹主動脈及內壁的病理變化，檢測血清中三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）以及白細胞介素6（IL-6）、IL-1β含量，檢測腹主動脈組織中Toll樣受體4（TLR4）、核因子κB p65（NF-κB p65）含量及其蛋白表達水平。結果：與假手術組比較，模型組兔腹主動脈管腔內膜富含脂質，管壁厚度和斑塊面積明顯增加，可見明顯的血管內皮損傷;血清中TG、TC、LDL-C、IL-6、IL-1β含量和腹主動脈組織中TLR4、NF-κB p65含量及其蛋白表達水平均顯著升高，HDL-C含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，心脈康高劑量組和辛伐他汀組兔腹主動脈病變減輕，且內壁未見明顯損傷，其TG、TC、LDL-C、IL-6、IL-1β含量以及心脈康低劑量組NF-κB p65含量和TLR4、NF-κB p65蛋白表達水平均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。結論：心脈康可改善兔AS，其機制可能與下調TLR4、NF-κB p65表達，抑制炎癥反應有關。

關鍵詞 心脈康;動脈粥樣硬化;Toll樣受體家族4/核因子κB信號通路;血脂代謝;炎癥反應;兔

Study on Mechanism of the Improvement Effects of Xinmaikang on Atherosclerosis in Rabbits Based on TLR4/NF-κB Signaling Pathway

ZHOU Zhihui1，CHEN He2，WU Jinbo1，YE Xiaohan1（1. Dept. of Cardiology， Dongguan Hospital， Guangzhou University of TCM， Guangdong Dongguan 523015， China; 2. The First Clinical Medical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510405， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To explore the mechanism of Xinmaikang improving atherosclerosis （AS） in rabbits. METHODS： A total of 50 male Zealand rabbits were randomly divided into sham operation group， model group， simvastatin group [positive control， 2.60 mg/（kg·d）] and Xinmaikang low-dose and high-dose groups [0.21， 0.84 g/（kg·d）]， with 10 rabbits in each group. Rabbits in sham operation group were fed with ordinary diet， and only femoral artery was separated and ligated， and abdominal aortic endothelium was not strained; the other groups were given high-fat diet and received abdominal aortic intimal balloon injury to induce AS model. Ten weeks after operation， sham operation group and model group were given intragastric administration of normal saline， and administration groups were given corresponding drug solution intragastrically （normal saline as solvent） with the volume of 100 mL， once a day， for consecutive 12 weeks. After last administration， the pathological changes of abdominal aorta and inner wall in rabbits were observed in each group. The serum contents of triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， low density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， interleukin-6（IL-6） and IL-1β were detected， and the contents and protein expression of Toll-like receptor 4 （TLR4） and nuclear factor-κB p65 （NF-κB p65） in abdominal aortic tissue were determined. RESULTS： Compared with sham operation group， the intima of abdominal aorta in model group was rich in lipids， the thickness of vessel wall and plaque area were increased obviously， and there was obvious vascular endothelial injury. The contents of TG， TC， LDL-C， IL-6 and IL-1β in serum， the contents and protein expression of TLR4 and NF-κB p65 in abdominal aorta tissue were significantly increased， while the content of HDL-C was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the lesion of rabbit abdominal aorta were alleviated， and no obvious damage was found on the inner wall. The contents of TG， TC， LDL-C， IL-6， IL-1β of Xinmaikang high-dose group and simvastatin group as well as the content of NF-κB p65 and protein expression of TLR4 and NF-κB p65 were improved significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Xinmaikang can improve AS in rabbits， and its mechanism may be assicated with inhibiting the expression of TLR4， NF-κB p65 and inhibiting inflammatory response.

KEYWORDS? ?Xinmaikang; Atherosclerosis; TLR4/NF-κB signaling pathway; Lipid metabolism; Inflammatory response; Rabbit

動脈粥樣硬化（AS）是動脈硬化性血管疾病中重要且常見的一種，是多種心腦血管疾病（如冠心病、血栓栓塞性疾病和腦血管病等）的病理基礎[1]。進入21世紀以來，全球AS的發病率呈逐年上升趨勢，對人類健康造成了嚴重威脅[2]。AS的發病機制尚未明確。近年來，多項研究提示，慢性炎癥在AS的發生發展中發揮著重要作用[3-4]。Toll樣受體4（TLR4）作為Toll樣受體家族（TLRs）中的一員，與配體結合后能夠促進核因子κB（NF-κB）發生核轉移，從而激活下游炎癥因子參與到AS的各個階段，故抑制TLR4/NF-κB信號通路可能是改善AS的潛在機制之一[5-6]。

現代醫學對AS的治療方法包括手術治療與藥物治療，但二者均存在一定的局限性，如患者經皮冠狀動脈腔內成形術后易發生再狹窄，長期服用他汀類藥物會對其肝臟、肌肉、腎臟以及糖代謝等造成負面影響，二者聯合則可能引發橫紋肌溶解[7-8]。中醫認為，AS屬本虛標實之證，陰虛、陽虛、氣虛為本，血瘀、痰濁、氣滯、熱毒、寒凝為標，可歸“脈痹”“積聚”的范疇[9]。心脈康由廣州中醫藥大學東莞醫院葉小漢教授創方，以鱉甲、三棱、莪術、枳實、制膽星和石斛等藥材組成，具有軟堅散結、益氣通脈的功效[10]。臨床研究證實，心脈康對AS患者具有顯著的治療作用[11-12]，但其分子機制尚未明確。本研究通過觀察心脈康對兔AS的影響，基于TLR4/NF-κB信號通路探究其改善兔AS的作用機制，旨在為心脈康的機制研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BX41TF型光學顯微鏡（日本Olympus公司）、LEO-1430VP型掃描電子顯微鏡（德國Zeiss公司）、Modular P800型全自動生化分析儀（瑞士Roche公司）、BondmaX型全自動免疫組化染色機（德國Leica公司）、Power Wave XS2型酶標儀（美國BioTek公司）、JS-680A型自動凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

心脈康片（批號Z20110041，規格0.75 g）由東莞市中醫院提供;辛伐他汀片（批號R018651，規格20 mg）購自荷蘭Merck Sharp V Dohme B.V.公司;0.5%油紅O染液（貨號SLBG0158V）購自美國Sigma公司;三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（批號分別為23743986、23451355、23377464、23460238）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒和TLR4、NF-κB p65免疫組化試劑盒（批號分別為A13267、A12347、A12567、A17267）均購自美國ABclonal Technology公司;蘇木精染液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、ECL化學發光試劑盒（批號分別為C0107、P0012A、P0012S、P0018FS）均購自上海碧云天生物技術有限公司;山羊抗小鼠TLR4單克隆抗體、山羊抗小鼠NF-κB p65多克隆抗體、山羊抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號分別為1358、8242、5174、7074）均購自美國Cell Signaling Technology公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為蒸餾水。

1.3 實驗動物

本研究所用實驗動物為普通級5月齡雄性新西蘭兔，共50只，體質量1.8～2.3 kg，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號為SYXK（粵）2018-0001。所有動物均飼養于普通級動物實驗室內，溫度為20～26 ℃，相對濕度為40%～70%，晝夜明暗交替（12 h/12 h）。高脂飼料（含1%膽固醇、5%豬油、94%普通飼料）、普通飼料均由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。本研究方案已通過廣州中醫藥大學實驗動物管理和倫理委員會批準，批件號為ZSLL-2015-45。

2 方法

2.1 造模

參考文獻[13]，采用高脂飼料喂養與腹主動脈內膜球囊損傷結合的方法復制兔AS模型，具體操作如下：用高脂飼料（100 g/d）喂養新西蘭兔2周后，再行腹主動脈內膜球囊損傷術——經耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，穿刺右股動脈，將內徑3.5 mm、長15 mm的球囊導管送入腹主動脈（插入深度約2.0 cm），充盈球囊并緩慢回拉球囊至動脈切口處，反復回拉3次，以造成腹主動脈內膜損傷和剝脫，術后繼續以高脂飼料喂養。術后10周根據油紅O的染色情況判斷是否建模成功。

2.2 分組與給藥

將50只新西蘭兔以普通飼料喂養2周后，隨機分為假手術組、模型組、辛伐他汀組[陰性對照，2.60 mg/（kg·d）]和心脈康低、高劑量組[0.21、0.84 g/（kg·d）]，每組10只。假手術組兔給予普通飼料喂養，只分離結扎股動脈但不損傷腹主動脈內皮，其余各組兔均按“2.1”項下方法復制AS模型。術后10周，假手術組和模型組兔灌胃生理鹽水，各藥物組灌胃相應藥液（溶劑均為生理鹽水），給藥體積均為100 mL，每天給藥1次，連續12周，給藥劑量均依據本課題組預實驗結果設置。

2.3 采樣方法

末次給藥后，用4%水合氯醛溶液麻醉各組兔，收集其腹主動脈血40 mL后，處死，分離腹主動脈。血樣于室溫下放置30 min后，以5 000 r/min離心15 min，取上層血清，備用。

2.4 兔腹主動脈的病理觀察

取各組兔腹主動脈，以石蠟包埋后切片（厚度約5 μm），脫蠟至水并經水洗后，在異丙醇中放置5 min，用濾紙吸去異丙醇，加入0.5%油紅O染色30 min;用水清洗3次，加入蘇木精染色5 min;用鹽酸-乙醇溶液（1 ∶ 100，V/V）分色、氨水返藍后，用中性樹膠封片，使用光學顯微鏡觀察其腹主動脈的病理變化（紅褐色為血脂沉積）。

2.5 兔腹主動脈內壁的病理觀察

取各組兔腹主動脈，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗表面后，快速放入2.5%戊二醛固定液中固定4 h;用PBS清洗5 min×4次，再放入1%鋨酸固定液中固定1 h;用PBS清洗5 min×4次，依次放入70%、80%、90%、100%乙醇中脫水10 min，徹底干燥后，使用掃描電子顯微鏡觀察其腹主動脈內壁的病理變化。

2.6 兔血脂指標含量的檢測

取各組兔腹主動脈血清樣品適量，按照相應試劑盒說明書方法操作，使用全自動生化分析儀檢測其血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C的含量。

2.7 兔血清中IL-1β、IL-6含量的檢測

采用ELISA法進行檢測。取各組兔腹主動脈血清樣品適量，按照相應試劑盒說明書方法操作，使用酶標儀檢測其血清中IL-1β、IL-6的含量。

2.8 兔腹主動脈組織中TLR4、NF-κB p65含量的檢測

采用免疫組化法進行檢測。取各組兔腹主動脈，以石蠟包埋后切片（厚度約5 μm），按照相應試劑盒說明書方法操作，使用全自動免疫組化染色機分別進行TLR4和NF-κB p65免疫組化染色，使用光學顯微鏡觀察并采集放大時的顯微圖像，同時運用Image J v1.8.0圖像分析軟件計算兔腹主動脈組織中TLR4、NF-κB p65在465 nm波長下的積分光密度（IOD），并以此表示兩者含量。

2.9 兔腹主動脈組織中TLR4、NF-κB p65蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取各組兔腹主動脈，經裂解、勻漿、靜置后，以12 000 r/min離心10 min，獲取蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度后，煮沸5 min使蛋白變性。取變性后的蛋白樣品經SDS-PAGE分離，轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，以5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h后，加入TLR4、NF-κB p65、GAPDH一抗（稀釋比例分別為1 ∶ 1 000、1 ∶ 200、1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;用TBST緩沖液洗滌10 min×3次，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 15 000），室溫孵育1 h;用TBST緩沖液洗滌10 min×3次，加入ECL化學發光顯色液顯影，于自動凝膠成像分析儀中成像。使用Sensi Ansys 13.0軟件進行分析，以目標蛋白與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目標蛋白的表達水平。

2.10 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析。數據均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗（方差齊）或Dunnetts檢驗（方差不齊）。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 兔腹主動脈的病理變化

假手術組兔的腹主動脈管腔內可見少許脂質，未見明顯斑塊和血管內皮損傷。與假手術組比較，模型組兔的腹主動脈管腔內膜富含脂質，管壁厚度和斑塊面積均明顯增加，可見明顯的血管內皮損傷。與模型組比較，心脈康低劑量組兔的腹主動脈結構相對完整，管腔內膜脂質沉積較少;心脈康高劑量組和辛伐他汀組兔的腹主動脈結構正常，局部有小灶性鈣化顆粒物沉積，病變輕微，斑塊小，彈力板基本完整。結果見圖1。

3.2 兔腹主動脈內壁的病理變化

假手術組兔的腹主動脈內壁光滑，未見明顯腫脹、損傷、粥樣硬化斑塊和泡沫細胞。與假手術組比較，模型組兔的腹主動脈內壁可見許多粥樣硬化斑塊，在斑塊表面可見纖維帽和泡沫細胞，在硬化斑塊上可見黏附的巨噬細胞，血管內皮損傷明顯。與模型組比較，心脈康低劑量組兔的腹主動脈內壁斑塊面積縮小，血管內皮損傷較輕;心脈康高劑量組和辛伐他汀組兔的腹主動脈內壁斑塊明顯較少，血管內皮相對完整，未見明顯損傷。結果見圖2。

3.3 兔血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量變化

與假手術組比較，模型組兔血清中TC、TG、LDL-C含量均顯著升高（P<0.01），HDL-C含量顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，心脈康高劑量組和辛伐他汀組兔血清中TC、TG、LDL-C含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），各藥物組HDL-C含量和心脈康低劑量組TC、TG、LDL-C含量差異均無統計學意義（P>0.05）。結果見表1。

3.4 兔血清中IL-6、IL-1β的含量變化

與假手術組比較，模型組兔血清中IL-6、IL-1β含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，心脈康高劑量組和辛伐他汀組兔血清中IL-6、IL-1β含量均顯著降低（P<0.01），心脈康低劑量組上述指標含量差異均無統計學意義（P>0.05）。結果見表2。

3.5 兔腹主動脈組織中TLR4、NF-κB p65的含量變化

與假手術組比較，模型組兔腹主動脈組織中TLR4、NF-κB p65含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各藥物組兔腹主動脈組織中TLR4（除心脈康低劑量組外）、NF-κB p65含量均顯著降低（P<0.01）。結果見圖3、圖4、表3。

3.6 兔腹主動脈組織中TLR4、NF-κB p65蛋白的表達水平變化

與假手術組比較，模型組兔腹主動脈組織中TLR4、NF-κB p65蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各藥物組兔腹主動脈組織中TLR4、NF-κB p65蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結果見圖5、表4。

4 討論

AS是一種慢性炎癥性疾病，是由脂質過度積累誘發內皮細胞、白細胞和內膜平滑肌細胞共同參與的動脈病變[14]。心脈康是由鱉甲、三棱、莪術、枳實、制膽星和石斛等藥材組成，其中鱉甲可滋陰潛陽、軟堅散結;三棱和莪術可破血消積、行氣止痛，現代藥理學研究提示兩者均能夠抑制炎癥、降低全血黏度和阻止血栓形成;枳實可破氣散痞、消積化痰;制膽星可清熱化痰，配合諸藥可增軟堅散結之功;石斛擅益胃生津、滋陰清熱，其提取物亦可降低全血黏度、抑制血栓形成;諸藥合用，共奏軟堅散結、益氣通脈之功[15-17]。

在AS病變過程中，血漿中的細胞因子和脂蛋白顆粒通過受損的血管內皮滲入至內皮下空間，通過氧化修飾等反應成為具有細胞毒性的化學物質，從而促進炎癥反應和AS進程[18]。本研究油紅O染色和掃描電子顯微鏡觀察結果提示，高劑量心脈康能夠保護AS模型兔的血管內皮，抑制其粥樣硬化斑塊形成。脂質代謝異常是AS最重要的危險因素之一[19]，本研究對各組兔的血脂指標進行分析，結果提示，高劑量心脈康能夠改善AS模型兔的血脂異常，下調血清中TC、TG和LDL-C含量，干預AS的進程。

炎癥在AS的所有階段都起著重要作用，是其起始和發展過程中生理和病理變化的共同基礎[20]。已有研究表明，炎癥因子IL-6和IL-1β的過度表達能夠提升炎癥細胞的黏附能力，IL-1β還可降低血栓調節素的表達，破壞凝血與抗凝血功能的平衡，導致血管內部凝血，從而促進AS的進程[21]。本研究結果提示，高劑量心脈康能夠下調AS模型兔血清中IL-6和IL-1β的含量，抑制炎癥反應，干預AS的進程。

有學者指出，心脈康可能通過降低血脂、減輕過氧化損傷等途徑來抑制兔AS的形成[22-23]。心脈康聯合化學藥治療具有較好的抗炎效果[24]。TLR4是介導天然免疫TLRs家族中的一員，是一種位于細胞膜表面的跨膜蛋白，參與多種免疫及炎癥反應，其在AS內皮細胞和斑塊上的表達水平明顯升高[25]。NF-κB是炎癥最重要的調節因子之一，其主要形式為p50和p65組成的二聚體，參與AS的病理進程[26-27]。有研究發現，ApoE-/-小鼠經NF-κB抑制劑干預后，其體內泡沫細胞的形成受到明顯抑制[28]。TLR4/NF-κB信號通路是機體重要的炎癥信號轉導途徑之一，血管內皮細胞內TLR4蛋白表達水平的上調能夠激活NF-κB，誘導腫瘤壞死因子α、IL-6和IL-1β等促炎性細胞因子的產生和釋放，從而促進AS斑塊的形成[29]。相關研究指出，抑制TLR4/NF-κB信號通路能夠下調炎癥因子的表達，從而減輕血管內皮細胞的受損程度，延緩AS的進程[30-31]。本研究通過構建AS模型兔，探究心脈康對TLR4/NF-κB信號通路及炎癥因子表達的影響，結果顯示，與模型組比較，心脈康低、高劑量組兔腹主動脈組織中TLR4（除低劑量組外）、NF-κB p65含量及其蛋白的表達水平均顯著降低，提示TLR4/NF-κB信號通路可能是心脈康改善兔AS的靶點之一。

綜述所述，心脈康可能通過下調TLR4、NF-κB p65的表達，抑制炎癥反應，從而延緩AS的發展。

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（收稿日期：2021-06-17 修回日期：2021-10-07）

（編輯：鄒麗娟）