LC-MS/MS法測定人血漿中吡咯替尼的濃度及其臨床應用

趙振寰 荊偉麗 劉濤 呂志強 曹志紅 徐文

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）22-2767-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.22.14

摘 要 目的：建立測定吡咯替尼血藥濃度的方法，并應用于臨床。方法：血漿樣本經甲醇沉淀蛋白后，以伊馬替尼為內標，采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法測定。以Ultimate AQ-C18為色譜柱，以甲醇（含0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸）為流動相進行梯度洗脫，流速為0.4 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為5 ?L。離子源為電噴霧離子源，以多反應監測模式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 583.4→138.3（吡咯替尼）、494.5→393.4（內標）。選擇2020年6-11月于青島大學附屬醫院接受吡咯替尼治療的乳腺癌患者30例，測定其用藥1周后的吡咯替尼穩態谷濃度。結果：吡咯替尼檢測質量濃度的線性范圍為5～300 ng/mL（r=0.999 3），定量下限為5 ng/mL;日內、日間RSD均不高于9.30%，相對誤差為-6.70%～5.04%;穩定性試驗的相對誤差為? -1.92%～5.42%;提取方法、基質效應、殘留效應均不影響待測物的定量分析。30例乳腺癌患者體內吡咯替尼的穩態谷濃度為32.6～82.8 ng/mL，平均血藥濃度為53.8 ng/mL，存在2.54倍的個體差異。結論：所建LC-MS/MS法操作簡便、靈敏度和準確度較高，可用于乳腺癌患者體內吡咯替尼的血藥濃度監測。

關鍵詞 吡咯替尼;液相色譜-串聯質譜法;伊馬替尼;乳腺癌;血藥濃度監測

Determination of Pyrrotinib Concentration in Human Plasma by LC-MS/MS and Its Clinical Application

ZHAO Zhenhuan，JING Weili，LIU Tao，LYU Zhiqiang，CAO Zhihong，XU Wen（Dept. of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Qingdao University， Shandong Qingdao 266003， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the determination of pyrrotinib concentration in plasma， and apply it in clinic. METHODS： After precipitated with methanol， the plasma sample was determined by LC-MS/MS using imatinib as internal standard. The determination was performed on Ultimate AQ-C18 column with mobile phase consisted of methanol （containing 0.1% formic acid） and water （containing 0.1% formic acid） （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 40 ℃， and the sample size was 5 ?L. The ion source was electrospray ionization source， and the positive ion scanning was carried out in multiple reaction mode. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 583.4→138.3 （pyrrotinib） and m/z 494.5→393.4 （internal standard）， respectively. Thirty breast cancer patients taking pyrrotinib were collected from the Affiliated Hospital of Qingdao University during Jun.-Nov. 2020 to determine their steady-state trough concentrations of pyrrotinib after a week of treatment. RESULTS： The linear range of pyrrotinib were 5-300 ng/mL （r=0.999 3）. The lower limit of quantification was 5 ng/mL. RSDs of intra-day and inter-day were not higher than 9.30%， and relative errors （REs） ranged -6.70%-5.04%. REs of stability tests were in the range of -1.92%-5.42%. The extraction method， matrix effect and residual effect did not affect the quantitative analysis of the substance to be tested. The steady-state trough concentrations of pyrrotinib were 32.6-82.8 ng/mL，with an average plasma concentration of 53.8 ng/mL; there was about 2.54 fold individual difference. CONCLUSIONS： Established LC-MS/MS method is simple， sensitive and accurate， and can be used for the plasma concentration monitoring of pyrrotinib in breast cancer patient.

KEYWORDS? ?Pyrrotinib; LC-MS/MS; Imatinib; Breast cancer; Plasma concentration monitoring

乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，其發病率在女性惡性腫瘤患者中排第1位，病死率排第2位[1]。有研究指出，15%～30%的乳腺癌患者的表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達呈陽性，其腫瘤侵襲性強、預后差[2-3]。HER2靶向治療藥物（如曲妥珠單抗等）的上市應用明顯改善了患者的預后，顯著延長了患者的生存期[4]。但是在這些靶向藥物的使用過程中，有部分患者出現了無法耐受的情況，嚴重影響了臨床治療的效果[5]。吡咯替尼是我國自主研發的小分子不可逆酪氨酸激酶抑制劑，適用于HER2陽性患者，包括既往使用其他靶向藥物反應性不強的患者[6]。該藥于2018年8月獲批上市，多項臨床研究已證實，其用于治療既往未接受或接受過曲妥珠單抗的復發或轉移性HER2陽性乳腺癌患者具有良好的效果[7-8]。由于多數靶向藥物的血藥濃度個體差異大，且血藥濃度與療效、不良反應的相關性較強[9-10]，因此可通過血藥濃度監測對患者用藥劑量進行個體化調整，以在保證療效的同時降低胃腸道等不良反應的發生風險。此外，由于吡咯替尼為藥物代謝酶細胞色素P450 3A（CYP3A）的底物，故影響該酶活性的藥物也可能會影響吡咯替尼的血藥濃度，因此在聯合用藥時可根據吡咯替尼的血藥濃度對其劑量進行調整[11]。

目前，關于吡咯替尼血藥濃度檢測的報道較少，僅有采用放射液相色譜法和超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）法分析吡咯替尼在人體內的藥動學過程[11-12]。但是放射液相色譜法不適用于臨床血藥濃度監測工作的常規開展，而UPLC-Q-TOF-MS法所用設備十分昂貴且普及率較低，均難以滿足臨床吡咯替尼血藥濃度監測的需求。液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法是目前檢測小分子藥物的最佳方法，該方法靈敏度高、專屬性強，在大型三級甲等醫院的普及率較高，也是國外檢測小分子靶向藥物血藥濃度的主要手段[13-14]?；诖耍狙芯拷⒘藴y定人血漿中吡咯替尼血藥濃度的LC-MS/MS法，同時采用該方法對接受吡咯替尼治療的乳腺癌患者體內的藥物濃度進行檢測，旨在為該藥的個體化應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有API 4000+型三重四極桿串聯質譜系統（美國AB公司），1290Ⅱ型UPHC及配套的G7120型溶劑泵、G7167B型進樣器、G7116B型柱溫箱（美國Agilent公司），5418型離心機（德國Eppendorf公司），DT5-6B型低速臺式自動平衡離心機（北京新時代北利醫療器械有限公司），BF-2000型氮氣吹干儀（北京八方世紀科技有限公司），Milli-Q型超純水機（美國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

馬來酸吡咯替尼對照品（批號20061501，純度>99%，以下簡稱“吡咯替尼對照品”）購自青島英納維生物科技有限公司;甲磺酸伊馬替尼對照品（內標，批號S102608，純度≥99%，以下簡稱“內標對照品”）購自美國Selleck Chemicals公司;健康人空白血漿由青島大學附屬醫院輸血科提供;乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購自德國Merck公司;甲酸（色譜純）購自美國Tedia公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 以Ultimate AQ-C18（100 mm×2.1 mm，3.0 ?m）為色譜柱，以甲醇（含0.1%甲酸，A）-水（含0.1%甲酸，B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.5 min，32%A;0.5～2.0 min，32%A→75%A;2.0～6.0 min，75%A）;流速為0.4 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣量為5 ?L。

2.1.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），以多反應監測（MRM）模式進行正離子掃描;碰撞氣壓力為6.00×104 Pa，氣簾氣壓力為2.00×105 Pa，霧化氣壓力為4.48×105 Pa，輔助氣壓力為4.48×105 Pa;噴霧電壓為 5 500 V;霧化溫度為550 ℃;去簇電壓分別為80 V（吡咯替尼）、92 V（內標）;碰撞能量分別為39 eV（吡咯替尼）、36 eV（內標）;用于定量分析的離子對分別為m/z 583.4→138.3（吡咯替尼）、494.5→393.4（內標）。吡咯替尼和內標的化學結構式及二級全掃描質譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取吡咯替尼對照品約10 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，混勻，制成質量濃度為200 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 標準曲線溶液和質控樣品溶液 取“2.2.1”項下對照品溶液適量，用甲醇稀釋，混勻，制成質量濃度分別為5、10、20、50、100、200、300 ng/mL的系列工作溶液;分別取上述系列工作溶液各50 ?L，置于試管中，于60 ℃下以氮氣流吹干，殘渣分別加入空白血漿50 ?L，混勻，制成質量濃度分別為5、10、20、50、100、200、300 ng/mL的系列標準曲線溶液。同法制備吡咯替尼質量濃度分別為10、50、200 ng/mL的質控樣品溶液。

2.2.3 內標溶液 取內標對照品約10 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，混勻，制成質量濃度為200 μg/mL的內標貯備液;取上述內標貯備液適量，用甲醇稀釋，混勻，制成質量濃度為150 ng/mL的內標溶液。

2.3 血漿樣品的預處理

取血漿樣品50 ?L，置于1.5 mL的離心管中，加入“2.2.3”項下內標溶液150 ?L，渦旋混勻2 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，置于進樣瓶中，待測。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿+吡咯替尼（質量濃度為10 ng/mL）、患者血漿樣品，按“2.3”項下方法預處理（空白血漿不加內標）后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，吡咯替尼和內標的保留時間分別約為3.7、3.5 min，空白血漿中的磷脂、氨基酸等小分子內源性物質對吡咯替尼及內標的測定無干擾，表明該方法專屬性良好。結果見圖2。

2.4.2 線性關系考察 取“2.2.2”項下系列標準曲線溶液，按“2.3”項下方法預處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測物的質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標、待測物與內標的峰面積之比（y）為縱坐標進行加權線性回歸（權重為1/x2），得吡咯替尼的回歸方程為y=6.9×10-3x+1.9×10-2（r=0.999 3），表明吡咯替尼檢測質量濃度的線性范圍為5～300 ng/mL，定量下限為5 ng/mL。

2.4.3 精密度與準確度試驗 取“2.2.2”項下質量濃度為5 ng/mL（即定量下限）的標準曲線溶液和10、50、200 ng/mL的質控樣品溶液各5 份，于1 d內按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，考察日內精密度;連續3 d按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，考察日間精密度。以實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，用相對誤差（RE）考察準確度。結果顯示，各樣品的日內、日間RSD均不高于9.30%，RE為-6.70%～5.04%，符合生物樣品定量分析的相關要求[15]。結果見表1。

2.4.4 穩定性試驗 按“2.2.2”項下方法制備10、50、200 ng/mL的質控樣品溶液，分別于室溫下放置24 h、 -20 ℃冰箱中放置30 d、反復凍融（-20 ℃～室溫）3次后，按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積，以實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，用RE考察樣品在室溫下放置、低溫下長期儲存和反復凍融條件下的穩定性。另取10、50、200 ng/mL的質控樣品溶液，按“2.3”項下方法預處理后，于4 ℃自動進樣器中放置12 h，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積，以實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，用RE考察經預處理后樣品在待測過程中的穩定性。每質量濃度各條件均平行5份操作，結果見表2。由表2可知，各樣品的RE為-1.92%～5.42%，表明其在上述各種條件下的穩定性良好。

2.4.5 提取回收率與基質效應考察 按“2.2.2”項下方法制備10、50、200 ng/mL的質控樣品溶液，分別按“2.3”項下方法預處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積A。取“2.2.1”項下對照品溶液，用75%甲醇稀釋，制成質量濃度分別為10、50、200 ng/mL的對照工作溶液，按“2.3”項下方法預處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積B。取空白血漿，按“2.3”項下方法預處理后，于60 ℃下以氮氣流吹干，得空白基質，用上述10、50、200 ng/mL的對照工作溶液復溶，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積C。提取回收率=A/C×100%，基質效應=C/B×100%。每質量濃度平行5份操作。結果顯示，吡咯替尼的平均提取回收率為93.52%～95.93%（RSD≤4.42%），平均基質效應為96.08%～97.53%（RSD≤3.05%）;內標的平均提取回收率為96.37%（RSD=3.51%），平均基質效應為97.67%（RSD=2.63%），表明基質不干擾樣本和伊馬替尼的測定。結果見表3。

2.4.6 殘留效應考察 取“2.2.2”項下300 ng/mL的標準曲線溶液，按“2.3”項下方法預處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，同法測定空白血漿以考察方法的殘留效應。結果顯示，在吡咯替尼和內標對應的保留時間處，空白血漿未見明顯的色譜峰，且噪音與5 ng/mL質控樣品相應色譜峰峰面積的比值小于0.17%，表明殘留效應不影響后續血漿樣品的測定。

2.5 臨床應用

2.5.1 納入與排除標準 本研究的納入標準為：（1）年齡大于18歲，體質量不限;（2）經病理學檢查確診為乳腺癌，原發病灶或轉移病灶經熒光原位雜交技術檢測并確診為HER2 陽性;（3）服用吡咯替尼1周以上且規律服藥，中途無中斷或更改劑量;（4）均簽署了知情同意書。本研究的排除標準為：（1）連續服用吡咯替尼短于1周或1周內更改劑量者;（2）不耐受不良反應而擅自減少藥物劑量或中斷服藥者;（3）1周內服用CYP3A或P-糖蛋白強抑制劑或誘導劑者;（4）妊娠期或哺乳期婦女。

2.5.2 資料來源 收集2020年6-11月于青島大學附屬醫院接受吡咯替尼治療的30例乳腺癌患者，平均年齡（49.2±5.3）歲。本研究方案經醫院醫學倫理委員會審核批準，批件號為QYFYWZLL26449。

2.5.3 用藥方法 所有患者均口服馬來酸吡咯替尼片[江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字H20180013，按C32H31ClN6O3計80 mg]每天1次，每次400 mg，連續服用至少1周。

2.5.4 檢測方法與檢測結果 待患者血藥濃度達到穩態后，于下次用藥前采集患者靜脈血3～5 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，以3 500 r/min離心10 min，分離上層血漿，置于EP管中，于-20 ℃保存。取上述血漿樣本，按“2.3” 項下方法預處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積，并根據隨行標準曲線計算患者血漿中吡咯替尼的質量濃度。每個樣本檢測1次。結果顯示，30例患者的吡咯替尼穩態谷濃度為32.6～82.8 ng/mL，高濃度約為低濃度的2.54倍，提示不同患者體內吡咯替尼的血藥濃度差異較大;平均血藥濃度為53.8 ng/mL，所有結果均在定量分析線性范圍內。結果見圖3。

3 討論

本課題組前期研究發現，吡咯替尼易于形成[M+H]+峰，且該母離子易形成更小的碎片離子，故采用MRM模式進行正離子檢測時的靈敏度較高;隨后對去簇電壓和碰撞能量等質譜參數進行優化，以進一步提高檢測的靈敏度，最終得到了“2.1.2”項下質譜條件。

因伊馬替尼與吡咯替尼化學結構相似且色譜保留時間相近，理化性質穩定且提取率高，加之方法學驗證的各項指標均能滿足生物樣品定量分析的相關要求[15]，故本研究選擇伊馬替尼為內標。本課題組前期預測了所測樣本的質量濃度，故在樣本預處理時采用甲醇蛋白沉淀法。結果顯示，吡咯替尼和內標的提取率高且穩定，雖然對樣本有一定程度的稀釋，靈敏度略有下降，但該方法操作簡便、快捷，靈敏度能滿足臨床血藥濃度監測的要求。在采用等度洗脫方式分離吡咯替尼和伊馬替尼時，所得色譜峰較寬且拖尾嚴重，待測成分易受基質效應的干擾，因此采用梯度洗脫，結果所得色譜峰峰形尖銳、不拖尾，基質效應不干擾測定。本課題組前期還發現，流動相中甲酸的濃度會顯著影響吡咯替尼和伊馬替尼的峰面積，為了提高檢測的準確性，本研究在有機相和水相中均加入了甲酸，隨著流動相中甲酸濃度的升高，吡咯替尼和伊馬替尼的響應強度均有所增強，當甲酸濃度達到0.1%時，響應強度增加不明顯，故為避免甲酸對色譜柱的損害，本研究選擇流動相中甲酸的濃度為0.1%。

目前，色譜法被認為是小分子靶向藥物血藥濃度監測的理想方法，主要包括液相色譜-紫外（LC-UV）法和LC-MS/MS法，但哪種方法更適合則主要由樣本中代謝產物的性質和濃度所決定[16]。有的小分子靶向藥物，如伊馬替尼在患者體內的血藥濃度較高，采用LC-UV法基本能滿足臨床需求。但隨著新藥開發的不斷進展，新一代小分子靶向藥物的活性更強、血藥濃度更低，LC-UV法已不能滿足臨床需求，而LC-MS/MS法專屬性較強，可以降低內源性物質和患者服用的其他藥物的干擾，更適合低血藥濃度藥物的監測[17]?？紤]到吡咯替尼在患者體內的血藥濃度較低，本研究選擇了靈敏度更高的LC-MS/MS法，該方法操作簡便，靈敏度和檢測效率均較高，適用于吡咯替尼的血藥濃度監測。本研究結果顯示，30例患者體內吡咯替尼的穩態谷濃度為32.6～82.8 ng/mL，高濃度約為低濃度的2.54倍，個體差異較大，這可能與吡咯替尼的體內代謝和轉運有關[9，11]。

綜上所述，本研究所建方法操作簡便、靈敏度和準確度較高，可用于乳腺癌患者體內吡咯替尼的血藥濃度監測。但由于該藥上市較晚，目前尚無明確的與有效性和安全性相關的血藥濃度范圍，雖然本研究初步測得部分患者的吡咯替尼穩態谷濃度，但個體差異較大，因此在后續研究中將擴大樣本量，并收集療效、不良反應等數據，以獲取該藥的臨床藥動學數據，并確保其療效和安全性。

參考文獻

[ 1 ] SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A. Cancer statistics，2018[J]. CA Cancer J Clin，2018，68（1）：7-30.

[ 2 ] XU B，HU X，ZHENG H，et al. Outcomes of re-treatment with first line trastuzumab plus a taxane in HER2 positive metastatic breast cancer patients after （neo） adjuvant trastuzumab：a prospective multicenter study[J]. Oncotarget，2016，7（31）：50643-50655.

[ 3 ] HARBECK N. Advances in targeting HER2-positive breast cancer[J]. Curr Opin Obstet Gynecol，2018，30（1）：55-59.

[ 4 ] COBLEIGH M，YARDLEY D A，BRUFSKY A M，et al. Baseline characteristics，treatment patterns，and outcomes in patients with HER2-positive metastatic breast cancer by hormone receptor status from SystHERs[J]. Clin Cancer Res，2020，26（5）：1105-1113.

[ 5 ] NEMETH B T，VARGA Z V，WU W J，et al. Trastuzumab cardiotoxicity：from clinical trials to experimental studies

[J]. Br J Pharmacol，2017，174（21）：3727-3748.

[ 6 ] MA F，OUYANG Q，LI W，et al. Pyrotinib or lapatinib combined with cape-citabine in HER2-positive metastatic breast cancer with prior taxanes，anthracyclines，and/or trastuzumab：a randomized，phase Ⅱ study[J]. J Clin Oncol，2019，37（29）：2610-2619.

[ 7 ] ZHOU C，LI X，WANG Q，et al. Pyrotinib in HER2-mutant advanced lung adenocarcinoma after platinum-based? ? chemotherapy：a multicenter，open-label，single-arm，phase ii study[J]. J Clin Oncol，2020，38（24）：2753-2761.

[ 8 ] 宋國紅，李惠平，邸立軍，等.真實世界吡咯替尼治療HER2陽性轉移性乳腺癌的療效及安全性[J].北京大學學報（醫學版），2020，52（2）：254-260.

[ 9 ] HUYNH H H，PRESSIAT C，SAUVAGEON H，et al. Development and validation of a simultaneous quantification method of 14 tyrosine kinase inhibitors in human? plasma using LC-MS/MS[J]. Ther Drug Monit，2017，39（1）：43-54.

[10] 尤國皎，喬逸，文愛東. 4種常用酪氨酸激酶抑制劑的藥動學特征[J].中國藥房，2016，27（13）：1854-1857.

[11] MENG J，LIU X Y，MA S，et al. Metabolism and dispo-? sition of pyrotinib in healthy male volunteers：covalent binding with human plasma protein[J]. Acta Pharmacol Sin，2019，40（7）：980-988.

[12] ZHU Y，LI L，ZHANG G，et al. Metabolic characterization of pyrotinib in humans by ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectro- metry[J]. J Chromatogr B，2016，1033/1034：117-127.

[13] 郭瑋，陳文祥，尚紅，等.液相色譜-質譜臨床應用建議[J].中華檢驗醫學雜志，2017，40（10）：770-779.

[14] 王國才，賀玖明.液相色譜質譜聯用技術在臨床檢測和代謝研究中的應用進展[J].國際檢驗醫學雜志，2018，39（22）：2750-2755.

[15] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S]. 2020年版.北京：中國醫藥科技出版社，2020：466-472.

[16] KOLLER D，VAITSEKHOVICH V，MBA C，et al. Effective quantification of 11 tyrosine kinase inhibitors and caffeine in human plasma by validated LC-MS/MS method with potent phospholipids clean-up procedure：application to therapeutic drug monitoring[J]. Talanta，2020，208：120450.

[17] MERIENNE C，ROUSSET M，DUCINT D，et al. High throughput routine determination of 17 tyrosine kinase inhibitors by LC-MS/MS[J]. J Pharm Biomed Anal，2018，150：112-120.

（收稿日期：2021-05-24 修回日期：2021-10-25）

（編輯：陳 宏）