鏈格孢菌產細交鏈孢菌酮酸條件的優化研究

許雁祥 唐 敏 李云仙 楊發忠

（1. 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650233；2. 西南林業大學化學工程學院，云南 昆明 650233）

近年來，國內外對鏈格孢菌（Alternariaalternata）及其毒素的研究日漸深入。已有的研究表明，鏈格孢菌能產生多種毒素，已報道的就已超過30種。這些毒素（包括細交鏈孢菌酮酸（TeA）、鏈格孢醇（AOH），騰毒素（Ten）等）種類繁多、活性多樣，統稱為鏈格孢霉毒素。目前研究比較多的是TeA，TeA主要來自鏈格孢屬（Alternariaspp.），如柑橘鏈格孢（A.citri）、蘿卜鏈格孢（A. japonica）、擬稻瘟交鏈孢（A. oryzae）、細交鏈格孢（A. tenuissima）等多種鏈格孢菌均能產TeA。該毒素是鏈格孢菌毒素中唯一的含氮代謝物，是公認最重要、活性最強的鏈格孢霉毒素[1]，其在自然界中有一套完整的講解途徑，活性強弱隨濃度增加而增強，存在顯著的濃度效應[2-4]。TeA屬于非寄主專化性毒素，作用譜廣，能誘導植物產生系統獲得性抗性，使植株抗病性或抗蟲性增強。研究表明，鏈格孢菌毒素細交鏈孢菌酮酸不僅會影響寄主葉片等組織器官的結構，還會對寄主植物質膜透性、光合作用、呼吸作用、酶活性、激素平衡等生理代謝過程產生嚴重影響[5-7]。

楊發忠曾采用鏈格孢菌粗毒素處理中國月季（Rosa chinensis）植株，能夠十分明顯地抑制月季長管蚜的生長繁殖[8]。進一步研究發現，鏈格孢菌毒素中能誘導植株對月季長管蚜產生抗性的活性成分主要是TeA，用一定濃度的TeA處理月季植株，并未對植株產生明顯傷害作用但是對月季長管蚜卻產生了明顯的驅避效應，鏈格孢菌毒素TeA用于防治月季長管蚜有很好的效果[8-16]。Patriaca 等[17]對分離得到的123株鏈格孢菌株研究發現，有72%的菌株產TeA，其中細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、鏈格孢（Alternariaalternata）、長柄鏈格孢（Alternarialongipes）、梨黑斑鏈格孢（Alternaria gaisen）和蘋果鏈格孢（Alternariamali）均能產TeA。何麗[18]對分離得到的10株交鏈格孢菌（Alternaria alternata）分析檢測4種鏈格孢菌毒素，檢測結果表明10株菌均產生TeA，且TeA檢出含量最高。TeA產毒菌株的產毒能力受外界物理因素的影響較大，在研究產毒條件的培養時，大多是用PDA作為培養進行研究，且對培養時間和光照條件的研究較少。TeA可以通過人工合成，但由于該物質同分異構體較多，人工合成的化合物活性低于生物提取[19]。本研究對獲得的一株鏈格孢屬真菌產TeA的培養條件進行篩選，分析了通過真菌培養方式獲得鏈格孢菌毒素細交鏈孢菌酮酸的方法，為以后把TeA作為一種綠色生物防治劑用于植物蟲害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

1.2 主要儀器及試劑

HPLC檢測設備為大連依利特公司的高效液相色譜儀，紫外－可見檢測器為UV230II，高壓恒流泵為P230II，7725i手動進樣器；旋轉蒸發儀（IKA RV8）；細交鏈孢菌酮酸（TeA，purity>97% Sigma?Aldrich）；甲醇（Sigma?Aldrich，色譜純）；乙腈（Sigma?Aldrich，色譜純）； 氨基柱（TSKgel Amide?80）.

1.3 菌株培養

從斜面保存的供試菌株邊緣挑取一塊大小5 mm左右的菌塊接種在PDA培養基[20]上，25 ℃黑暗倒置培養至菌落長至一定大小時，挑取邊緣菌絲再次轉接到PDA培養基上，并在相同條件下擴大培養至鋪滿平板20 d后，待用。

1.4 毒素粗提取物的制備

按1.3的方法培養供試菌株，每組設3個平板。培養結束后，將培養基和菌落一同切成約1 cm×1 cm的小塊置于錐形瓶中，加入一定體積（以剛好沒過被提取材料為準）的有機萃取液（V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（冰醋酸）=80∶15∶5），提取 3次，至萃取液無色，將萃取液合并采用濾紙過濾，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至干。用4 mL甲醇溶解固體萃取物，即得毒素粗提物，于4 ℃下保存，備用。每組實驗設5個重復。

1.5 毒素TeA的檢測

采用HPLC測定粗毒素中的細交鏈孢菌酮酸含量，檢測條件為流動相：100%乙腈；流速：0.6 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：280 nm；色 譜 柱 為：TSKgel Amide?80 氨 基 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。配制系列濃度的標準品溶液，采用上述條件上機測試，根據濃度?峰面積建立回歸方程。相同條件下測試供試菌株毒素粗提物中的TeA，并利用回歸方程計算其含量。

1.6 供試菌株產毒素（TeA）單因素條件篩選

1.6.1 培養基的影響

分別采用PDA、PSKA、改良Fries、查彼（Czapek）、理查（Richard）和改良M?1?D等6種培養基[19]接種供試菌株，并按照上述方法（見1.3、1.4）培養菌株、制備毒素粗提物和測定TeA的含量，每種培養基設5個重復。

1.6.2 溫度、培養時間、光照條件

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分別設置15、20、25、30、35 ℃ 5個溫度梯度，10、15、20、30、35 d 5個培養時間和黑暗、12 h光照12 h黑暗交替、24 h持續光照3個光照條件，按1.2的方法分別在所設置的不同條件下，選用實驗篩選出的最佳培養基培養菌株，然后按1.4的方法制備毒素粗提物和進行TeA的含量測定，所有實驗每個條件下均設5個重復。

1.7 產毒條件的響應面優化

在單因素實驗的基礎上，采用最佳培養基對產毒培養條件（培養時間、溫度和光照）做進一步優化，以確定最優的實驗條件。根據中心響應面試驗原則建立3因素3水平的響應面實驗，并采用Design?Expert 10.0.3軟件進行優化分析。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法測定細交鏈孢菌酮酸

圖1為標準品細交鏈孢菌酮酸（TeA）的HPLC分析結果。利用TSKgel Amide?80氨基柱在洗脫體系為100%乙腈下對標準品進行洗脫時效果最好，峰規整單一。圖2為菌株粗毒素在相同條件下測得的HPLC圖譜，圖2中7號峰保留時間與TeA標樣保留時間非常接近可認為是同一種物質產生的色譜峰。

圖1 標準品TeA的HPLC分析Fig. 1 HPLC analysis for standard TeA

圖2 菌株5390粗毒素HPLC圖譜Fig. 2 HPLC map of crude toxin of strain 5390

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 不同培養基對供試菌株產TeA的影響

培養基種類對5390菌株產TeA的影響很大，存在明顯差異，結果見表1。由表1可以看出，菌株在改良M?1?D培養基上培養后，提取的粗毒素中未檢出TeA，而在理查和查彼培養基上，其含量較高，可分別達到13.31 μg/g和12.24 μg/g，與其余4種培養基（PSKA、改良M?1?D、PDA、改良Fries）相比，差異達到極顯著水平。

表1 不同培養基對TeA含量的影響Table 1 Effects of different media on TeA content

2.2.2 培養溫度對TeA含量的影響

培養溫度對5390菌株產TeA的含量影響較大，結果見表2。由表2可知，菌株產TeA量較高的溫度為25 ℃和30 ℃，分別為13.31μg/g和12.90 μg/g，在這2個溫度下產毒量沒有顯著差異，當溫度為15 ℃和35 ℃時TeA含量顯著下降，與25 ℃和30 ℃時的TeA含量存在極顯著差異。

表2 不同溫度對TeA含量的影響（μg/g）Table 2 Effects of different temperature on TeA content

2.2.3 培養時間對TeA含量的影響

培養時間對菌株5390產毒素TeA也有一定的影響。由表3可知，培養時間為10 d時，粗毒素提取物中未檢出TeA，隨著培養時間的增加，TeA含量也有所增加，培養25 d時，TeA含量最高，達到13.99 μg/g，之后再延長培養時間，TeA含量雖有所下降，但沒有顯著差異。

表3 不同培養時間對TeA含量的影響Table 3 Effects of different time on TeA content

2.2.4 光照條件對TeA含量的影響

改變光照條件，菌株5390產TeA含量也隨之改變，結果見表4。由表4可知，菌株在黑暗條件下培養，粗毒素中TeA含量較高，達到13.31 μg/g，12 h光照12 h黑暗交替培養，粗毒素中TeA含量明顯降低，下降幅度達到25.5%，24 h光照培養，TeA含量最低，只有6.44 μg/g。黑暗條件培養與12 h光照12 h黑暗交替培養，以及24 h光照培養相比，TeA含量差異達到極顯著水平。

表4 不同光照條件對TeA含量的影響Table 4 Effects of different illumination condition on TeA content

在以上培養條件下，菌株5390使用理查培養基，培養溫度在25～30 ℃之間，黑暗培養20～30 d時產TeA含量較高，因此擇理查培養基對菌株5390進行深入研究，用響應面法對其培養條件進行進一步優化。

2.3 產毒條件的響應面優化結果

根據以上試驗結果，進行響應面培養條件的優化，用HPLC法測定TeA含量作為響應值，參考上述單因素試驗結果所確定反應條件的基礎上，根據中心響應面試驗原則，以光照條件、培養溫度、培養時間3因素設計了3因素3水平的響應面試驗，試驗因素水平設計見表5。其中“0”為3水平單因素試驗最優條件，“?1”為低水平，“1”為高水平，考查的響應值y為TeA含量。

表5 響應面分析因素與水平Table 5 Analytical factors and levels for RSA

采用Design?Expert 10.0.3統計軟件對實驗結果進行響應面回歸分析，實驗設計方案及TeA含量響應值見表6。

表6 響應面實驗設計及結果Table 6 Experimental design and results of response surface

建立5390菌株最佳產毒素（TeA）條件參數的回歸模型，獲得評價指標響應值對自變量A、B、C二次多項式回歸方程：

對該模型進行方差分析及模型系數進行顯著性檢驗，以TeA含量為評價指標，結果表明回歸模型（P<0.000 1<0.01）達到極顯著水平，證明模型有意義；失擬值不顯著（P=0.84>0.05），說明模型擬合度好；模型的校正決定系數R=0.984 5，說明此模型能解釋98.45%響應值的變化，實驗誤差小。

通過分析回歸模型系數顯著性檢驗結果并作出響應的曲面圖，見圖3，4，5，在所選取的各因素水平范圍內，按照對響應值的影響順序為：光照條件>培養時間>培養溫度，其中光照條件對TeA含量的影響極顯著。光照條件與培養溫度交互作用響應面圖坡度較陡（圖3），對TeA含量的影響顯著（P= 0.018 8 < 0.05），光照條件與培養時間交互作用響應面圖坡度也較陡（圖4），說明對TeA含量的影響也較大，P=0.075 4接近顯著水平。培養溫度與培養時間之間相互作用的響應面圖坡度比較平緩（圖5），對TeA含量的影響不顯著（P=0.776>0.05）。

圖3 培養溫度與光照條交互作用對TeA含量的影響Fig. 3 Effect of interaction between temperature and light on TeA content

圖4 培養時間與光照條交互作用對TeA含量的影響Fig. 4 Effect of interaction between time and ligh ton TeA content

圖5 培養時間與培養溫度交互作用對TeA含量的影響Fig. 5 Effect of interaction between temperature and time on TeA content

3 結論與討論

鏈格孢菌產毒能力受外界物理因素的影響較大，在不同培養基、不同培養溫度、不同培養時間和光照條件下，鏈格孢菌產毒素TeA的量有所差別甚至達到極顯著差異。本研究對影響鏈格孢菌產毒的培養條件（培養基、培養溫度、培養時間及光照）進行研究發現，培養基種類對5390菌株產TeA的影響很大，在理查和查彼培養基上，其含量較高；培養溫度對TeA含量有較大影響，菌株在25 ℃和30 ℃ TeA產量較高，當溫度為15 ℃和35 ℃時TeA含量顯著下降，與25 ℃和30 ℃時的TeA含量存在極顯著差異。隨著培養時間的增加，TeA含量也有所增加，培養25 d時，TeA含量最高，之后再延長培養時間，TeA含量雖有所下降，但沒有顯著差異。黑暗條件培養與12 h光照12 h黑暗交替培養，以及24 h光照培養相比，TeA含量差異達到極顯著水平，菌株在黑暗條件下培養，粗毒素中TeA含量較高。在單因素實驗的基礎上，選擇理查培養基，用響應面法對培養條件作進一步優化，以光照條件、培養溫度、培養時間3因素設計了3因素3水平的響應面試驗，得到最優條件為：黑暗培養，溫度30 ℃，培養時間29 d。在此條件下作驗證試驗，TeA含量為14.99 μg/g與模型預測接近。

HPLC是檢測TeA的主要方法之一，它具有快速、準確、穩定等特點，因此被廣泛應用于TeA的檢測[21]。目前文獻記載的高效液相色譜法測定TeA所用的色譜柱均為C18反相柱，本實驗發現使用氨基柱分析測定TeA，粗毒素中其他毒素與TeA能很好的分離，與使用C18反相柱相比分離效果更好。

TeA對中國月季上的月季長管蚜有驅避效應，對其他害蟲是否有活性還需要進一步研究。TeA是由鏈格孢菌產生的次生代謝產物，在自然界中有一套完整的降解途徑，對環境無污染，是一種綠色無公害的生物防治劑。優化鏈格孢菌產TeA的培養條件，找到鏈格孢菌產TeA的最佳條件，可為TeA的進一步開發利用提供理論保障，也為綠色環保、可持續發展的現代植物保護理念添磚加瓦。