茶樹菇復合群菌株內ITS序列異源特征分析

錢 蓉 柴紅梅 趙永昌 陳玉惠 陳衛民

（1. 西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650233；2. 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650221；3. 云南省農業生物技術重點實驗室，云南 昆明 650223；4. 農業部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南 昆明 650223）

茶樹菇（Cyclocybe aegerita）是一個包含多個形態學上相似群體的復合種群[1]，多生長于柳樹或茶樹腐朽的枝椏部位。茶樹菇作為一種美味的食用類真菌，在東亞地區被廣泛種植，為我國的第九大類人工培養食用菌，年產量約50萬t[2]。利用ITS和線粒體小亞基（mtSSU rDNA）序列，研究者對我國西南地區的茶樹菇復合群進行了系統研究，發現這些菌株顯示出高多態性，同時還定義了一個新種C. salicacola[3]。因而，系統分析我國的茶樹菇菌株資源非常必要，同時也為種質資源的發掘與利用奠定基礎。

以往研究中，茶樹菇復合群系統研究多使用線粒體小亞基mtSSU序列[4-7]。研究者從茶樹菇中克隆獲得了完整的mtSSU序列，并構建了DNA二級結構[8-9]。群體分析顯示，mtSSU的V4?6?9區序列能夠將田頭菇屬內不同種很好的區分開來，而同一物種來自于不同菌株中的該區域序列則一致[10]。依據該序列特征，從世界各地收集的菌株被分為3個大的類群[11]，而我國西南地區的茶樹菇菌株也被分為3個類群[3]。

在真菌中，ITS序列作為最常用的分子標記，常用于物種識別及系統學研究[12-15]，然而，ITS序列變異（菌株內或菌株間）直接影響了菌株鑒定和系統學分析[16-30]。對于一些ITS序列高度分化的物種，子代同核體雜交后產生的菌株存在ITS異源的現象[31]。茶樹菇復合群包括多個群體[32]，本研究中也發現了一些菌株存在ITS異源現象，分析它們的結構特征及系統關系有助于深入理解茶樹菇類群的分化特征。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗收集了15個茶樹菇菌株，分別來自福建（AC0001，AC0021，AC0005 和AC0007），云南（YAASM2135 和 YAASM2136）和江西（AS-1，AS-2，CHA3，CHA5，YSG，C45，C89，YSD1H和BAICHA）。所有的菌株保存在YPD 培養基（0.2% 酵母提取物，0.2% 蛋白胨，2% 葡萄糖和2% 瓊脂）上。另有27個菌株的ITS和mtSSU序列來自于Genbank數據庫（表1）。

表 1 來源于Genbank數據庫的序列特征Table 1 Sequence characterization from Genbank database

續表 1

1.2 單孢分離

分別收集8個菌株（AC0001，AC0021，AC0005，AC0007，AS1，AS2，YSD1H 和CHA3）子實體產生的孢子，用無菌水稀釋后涂布到YPD培養基上，置于25 ℃培養箱中，挑取萌發的菌落進行轉接，在顯微鏡下觀察菌絲的鎖狀結構，來判定菌株是否為同核體。

1.3 DNA提取

實驗菌株接種到YPD培養基上，25 ℃培養7～10 d，收集1 g的菌絲置于液氮中研磨后，用DNA提取試劑盒（Qiagen's DNeasy Plant Mini kit）進行純化提取。

1.4 PCR擴增、克隆及測序

使用3對引物V4F（CTTACTATAAGTGTTGTC）和V4B（TATTCTACTTAGTATCTT），V6F（TTAGTCGGTCTCGGAGCA）和V6B（TGACGA CAGCC ATGCAAC），以及V9F（CCGTGATGA ACTAACCGT）和V9B（TTCCAGTACAA GCTA CCT）分別擴增mtSSU的V4，V6和V9區[10]。利用引物對ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG）和ITS4（TCCTCC GCTTATTGATATGC）擴增ITS1-5.8S-ITS2區[33]。反應體系為：12.5 μL 2×TaqPCR MasterMix，1 μL DNA，1 μL正/反向引物，9.5 μL無菌水。擴增后的產物膠回收后直接測序。序列使用Chromas Lite 2.1.1進行查看，產生雙峰序列的產物克隆到PGM?T載體中進一步測序。

1.5 依據ITS和mtSSU序列的系統分析

使用MEGA6軟件包中的MUSCLE對ITS和mtSSU序列進行多序列比對[34]，去除兩端的模糊序列后，構建最大相似性樹（Maximum Likelihood，ML），最優模型分別為HKY+G和T92+I，分支可信值采用1 000次重復計算分析。

2 結果與分析

2.1 供試菌株的測序結果及ITS異源序列

供試茶樹菇菌株mtSSU和ITS測序結果（表2）顯示，15個菌株的mtSSU中的V4、V6和V9區長度分別為193～282、156～165 nt和246 nt。15個菌株中來自福建和江西的各4個菌株的ITS產物直接測序呈現出套峰（雙峰），表明這些菌株中的區存在異源序列。

表2 供試菌株的序列特征Table 2 Sequence characterization of tested strains

對8個ITS區存在異源序列的菌株分別挑取10～15個子代同核體進行測序。結果顯示，依據測序序列，每個菌株的子代同核體都被分為2種類型，type1和type2（表3、圖1），表明這些異核體菌株可能為帶有異源ITS的同核體雜交而成。

比對分析后發現，變異位點均位于ITS1和ITS2區，這些位點有單核苷酸多態性或插入/缺失等類型，數量3～8個不等，其中在181位點處，所有的菌株中均存在插入/缺失現象（圖1）。這些菌株中ITS序列的相似性為97.71%～99.50%（表3）。

圖1 異源ITS序列特征Fig. 1 Sequence characterization of heterologous ITS

表3 ITS序列特征Table 3 Sequence characterization of ITS

2.2 ITS序列變異和嵌合特征

為了分析克隆序列的真實性，從8個ITS異源菌株的PCR產物中分別挑取8～12個克隆子進行測序，各獲得2或4種差異序列，去除掉與同核體相同的序列后，在AC0001、AS1和YSD1H菌株中各發現2種嵌合序列，占克隆子比例的30.00%～41.67%（表4）。序列比對顯示，3個菌株的ITS1和ITS2區發生了模板轉換，其中的415～455區和555～570區為轉換熱點（圖2）。

表4 ITS片段克隆子序列特征Table 4 Sequence characterization of ITS clones

圖2 ITS序列模板轉換Fig. 2 Template switching regions of ITS sequences

2.3 mtSSU序列系統樹特征

利用15個供試菌株的mtSSU序列和來自Genbank數據庫的26個菌株mtSSU序列構建系統發育樹。結果顯示，它們被分為2個類群：類群1）包括C. wrightii和C. salicacola兩個種；類群2）包括3個分支mtI，mtII和mtIII。3個C. salic-acola菌株和來自歐洲的菌株WT10/12聚在一起，而來自我國東南地區的一些菌株（除去AC0021）和來自南美的菌株WT44聚在mtI分支上。分支mtII上聚著CHA5、AC0001、BAICHA、YSG和來自東亞的Ac2，而剩余的菌株聚在mtIII分支上（圖3）。

圖3 依據mtSSU V4?V6?V9區序列構建的聚類樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed by mitochondrial small subunit(mtSSU) rDNA V4-V6-V9 sequences

2.4 ITS序列系統樹特征

利用供試15個菌株的ITS序列和來自Genbank數據庫的10株云南菌株的ITS序列構建的ML樹，其結果與mtSSU系統樹的拓撲結構不同。15個實驗菌株被分為3個群體，RI，RII，和RIII，其中RI又分為4個分支：Ria，RIb，RIc和RId。云南地區的菌株被分到了2個大的群體RI和RII中。此外，同1個菌株的異源ITS被分到不同類群中，如AC0001菌株的type2位于RIc分支上，而type1型位于RIII群體（圖4）。

圖4 依據ITS序列構建的聚類樹Fig. 4 Phylogenetic tree constructed by ITS rDNA sequences

3 結論與討論

ITS序列是真菌系統學研究中最常用的分子標記。然而，研究發現一些真菌物種中存在的基因組內ITS異源可能會給物種鑒定和系統學研究帶來干擾[23,28-29,35]。

本研究在8個茶樹菇菌株中發現了ITS異源特征，子代同核體測序分析表明了它們可能是攜帶異源ITS序列的同核體雜交形成的，這與前期自然環境中其它物種（Gymnopus dichrous和Hygrocybe flavescens/chlorophana）存在的現象類似[31]。然而攜帶不同異源ITS的菌株為何能夠在傳代過程中穩定保持該序列，而不是如大多數菌株一樣最終演變成一致的序列，其潛在的遺傳特征值得后期深入研究。

在使用DNA混合模板時，PCR擴增能夠產生嵌合序列[36-37]，從而產生不正確的序列信息。在本研究的8個ITS異源菌株中，也發現了ITS嵌合序列。有研究者也曾對Gymnopus dichrou菌株ITS區域的復制模板轉換進行了研究[31]，發現一些區域是交換的熱點，這與本研究中發現的結果相似。然而，目前還不清楚造成模板轉換的原因是否與DNA二級結構相關。這些結果也提示ITS雜合的菌株中提取該序列信息時，獲取同核體ITS序列非常必要，而直接獲得的克隆子可能包含錯誤的序列信息。

依據ITS和mtSSU V4?6?9序列構建的聚類樹在拓撲結構上存在差異，如從云南收集的8個菌株在ITS樹上被非為2個大的類群，而在mtSSU樹上則聚在一起。另外，來自同一菌株的異源ITS序列分布到不同的類群中，如AC0001，AC0021，AC0007和YSD1H菌株。以上結果表明，茶樹菇ITS多樣性較高，異源現象普遍存在，因此，在菌株鑒定和系統構建時，需要充分考慮異源ITS序列的差異對菌株鑒定的影響。