產(chǎn)β-葡萄糖苷酶微生物的篩選鑒定及其在人參皂苷Compound K轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

張慶鋒，呂世鑫，江雨欣，王丹丹，王洪濤

（煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

西洋參（Panax quinquefolius）是五加科人參屬多年生草本植物。2020年1月，西洋參被國(guó)家衛(wèi)健委列入既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點(diǎn)名單。西洋參作為藥食同源植物具有極高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。人參皂苷是西洋參的主要活性成分，以Rb1、Re和Rg1皂苷為主。在腸道菌和酶的作用下，主要皂苷轉(zhuǎn)化為具有更高藥理活性的稀有皂苷如C-K、Rh1苷元等被人體吸收后起藥效。稀有皂苷C-K具有抗腫瘤、抗炎、改善記憶、緩解動(dòng)脈硬化等多種藥理活性［1］。但人參皂苷C-K在天然西洋參或人參中并不存在，是二醇類皂苷在人腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物［2-4］。因此，如何有效獲得大量和高純度的稀有皂苷C-K成為研究的熱點(diǎn)，也是西洋參產(chǎn)品和深加工行業(yè)升級(jí)的關(guān)鍵。

稀有人參皂苷C-K和主要皂苷Rb1在苷元結(jié)構(gòu)上相同，側(cè)鏈的糖基種類和數(shù)量不同，因此可以選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄋ庠碥誖b1上的特定糖基制備稀有人參皂苷C-K［5-7］。目前制備稀有皂苷的方法主要有化學(xué)轉(zhuǎn)化法和生物轉(zhuǎn)化法，其中生物轉(zhuǎn)化法包括酶解法和微生物法。化學(xué)轉(zhuǎn)化法反應(yīng)條件要求高，副產(chǎn)物較多，所用試劑毒性較大［8，9］；酶解法反應(yīng)條件較為溫和，具有高度專一性，但反應(yīng)條件不易控制，酶易失活；微生物轉(zhuǎn)化法具有發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件溫和、酶系復(fù)雜、能轉(zhuǎn)化多種底物的優(yōu)勢(shì)。Yoo等［10］利用從泡菜中分離出來(lái)的短乳桿菌FR-B發(fā)酵人參細(xì)根，5 d后產(chǎn)生大量的稀有人參皂苷C-K，由此表明短乳桿菌FR-B是較好的微生物轉(zhuǎn)化食用菌。卲淇等［11］從市售的酸奶、酸菜、辣白菜分離出4株具有轉(zhuǎn)化能力的乳酸菌，有兩株可以把人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷F2，另外兩株把人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷C-K，轉(zhuǎn)化效果較好。Duan等［12］采用單變量試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法確定了蝸牛酶催化人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷C-K的最佳水解條件。本研究從西洋參的根際土壤中分離菌株，利用轉(zhuǎn)化試驗(yàn)篩選出一株可以高效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1為人參皂苷C-K的菌株，并通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化皂苷的轉(zhuǎn)化條件，以期為利用微生物轉(zhuǎn)化Rb1為稀有皂苷C-K的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西洋參根際土壤，采自威海市文登區(qū)的西洋參種植園；人參皂苷Rb1（CAS號(hào)：41753-43-9）、人參皂苷Rd（CAS號(hào)：52705-93-8）、人參皂苷F2（CAS號(hào)：62025-49-4）、人參皂苷C-K（CAS號(hào)：39262-14-1）（純度≥98%，貴州迪大科技有限責(zé)任公司）；Silica gel 60 F254型薄層層析板（德國(guó)Merk公司）；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒（山東思科捷生物技術(shù)有限公司）；R2A瓊脂培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BG-160型恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津制作所）；DYY-10C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Microchemi 4.2型紫外凝膠成像儀（以色列DNR成像系統(tǒng)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微生物的分離純化 稱取西洋參根際土樣10 g，溶解到盛有90 mL無(wú)菌水的燒杯中，制成10-1g/mL土壤濁液，然后依次梯度稀釋，得到10-2～10-6g/mL的土壤濁液。在無(wú)菌條件下將不同濃度梯度的土壤稀釋液分別涂布在R2A固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1～2 d。挑取形態(tài)不同的單菌落，利用單菌落劃線法得到純化的菌株，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選 利用Esculin agar法［13，14］篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。將分離純化得到的菌株劃線到E-R2A培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1～2 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化，將菌落周圍培養(yǎng)基變黑的菌株劃線培養(yǎng)備用。

1.3.3 皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測(cè) 在1.5 mL的EP管中加入0.4 mg/mL的Rb1溶液400μL，用接種環(huán)取適量活化的菌株加入到EP管中，渦旋振蕩使其混合均勻，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周，加入200μL飽和正丁醇，振蕩混勻，12 000 r/min離心10 min，吸取10μL上清液用于TLC分析；用同樣的方法萃取3次，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，復(fù)溶于400μL甲醇，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后用于HPLC分析。TLC檢測(cè)：采用Silica gel 60 F254型薄層層析板；展開(kāi)劑為氯仿+甲醇+水（65∶35∶10，體積比，下層）［15，16］；顯色劑為10%硫酸溶液。110℃烘干5 min顯色。HPLC檢測(cè)［17］：色譜柱為BDS HYPERSIL C18柱（250 mm×4.6 mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量為20μL；體積流量1.0 mL/min；柱溫45℃，流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度條件

1.3.4 皂苷轉(zhuǎn)化率的測(cè)定 用分析天平準(zhǔn)確稱取10 mg人參皂苷C-K粉末溶解于10 mL色譜級(jí)甲醇溶液中，配制成1 mg/mL的溶液，再依次稀釋為0.40、0.30、0.20、0.10、0.05 mg/mL；用0.45μm濾膜過(guò)濾后采用1.3.3的檢測(cè)條件進(jìn)行HPLC分析，平行試驗(yàn)3組取平均值；以峰面積為縱坐標(biāo)，以人參皂苷C-K的濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=4834.7X-54432，R2=0.9996。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算轉(zhuǎn)化生成的皂苷C-K的濃度。皂苷轉(zhuǎn)化率（%）=轉(zhuǎn)化生成的C-K的量/初始加入的Rb1的量×100。

1.3.5 菌株的分子生物學(xué)鑒定 按照細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取待測(cè)菌株的基因組DNA，使用通用引物b27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′）和b1492R（5′-TACGGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）對(duì)菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增［18-20］。PCR反應(yīng)體系（20μL）：基因組DNA 1μL，上游和下游引物各2μL（0.5μmol/L），2×Taq Plus PCR預(yù)混液10μL，加超純水補(bǔ)齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳條件為130 V、250 mA、25 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。純化后的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。所得菌株的DNA序列信息通過(guò)NCBI Blast與Gen-Bank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.6 單因素試驗(yàn) 取一定量的菌液于1.5 mL的EP管中，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，再加入1 mg/mL的人參皂苷Rb1溶液200μL，渦旋振蕩混勻，以人參皂苷C-K的轉(zhuǎn)化率為試驗(yàn)指標(biāo)，分別考察反應(yīng)溫度（20、25、30、37、45℃）、菌液濃度（1.5×108、3.0×108、4.5×108、6.0×108、7.5×108、9.0×108、10.5×108cfu/mL）、pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、轉(zhuǎn)化時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7、8 d）4個(gè)因素對(duì)人參皂苷C-K轉(zhuǎn)化率的影響，試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以菌液濃度（A）、轉(zhuǎn)化pH值（B）、轉(zhuǎn)化時(shí)間（C）3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以C-K的含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平（表2），進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化人參皂苷CK的轉(zhuǎn)化條件。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

1.3.8 轉(zhuǎn)化路徑分析 取一定量的菌液于1.5mL的EP管中，加入pH 6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液200μL，再加入1 mg/mL的人參皂苷Rb1溶液200μL，渦旋振蕩混勻，在37℃保溫箱分別轉(zhuǎn)化6、12、24、48 h。以轉(zhuǎn)化0 h的樣品為對(duì)照組，經(jīng)萃取、旋蒸、復(fù)溶和過(guò)濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用Design Expert 10進(jìn)行多元回歸擬合及響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1為C-K的菌株篩選

將純化后的菌株在七葉苷培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，觀察培養(yǎng)基顏色變化，挑選產(chǎn)黑色水解斑的菌株進(jìn)行下一步皂苷轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。TLC分析檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，在挑選出的一系列菌株中，菌株S’4可以將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷CK。

圖1 轉(zhuǎn)化Rb1菌株的薄層層析結(jié)果

2.2 菌株的分子鑒定

將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明菌株S’4與Cohnella thermotolerans CCUG 47242同源性為99.72%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2）表明，該菌株與Cohnella thermotolerans CCUG 47242處于同一分支。確定S’4菌株為耐熱科恩氏菌。

圖2 根據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的S’4菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.3.1 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 隨著轉(zhuǎn)化溫度的升高，皂苷C-K的轉(zhuǎn)化率呈先上升后下降趨勢(shì)，37℃時(shí)轉(zhuǎn)化率最高（圖3）。溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖最重要的因素之一，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶的催化活性也逐漸升高，微生物的生長(zhǎng)繁殖速度加快；超過(guò)37℃時(shí)，皂苷轉(zhuǎn)化率下降，可能由于溫度過(guò)高導(dǎo)致酶的催化活性下降。因此確定37℃為C-K的最佳轉(zhuǎn)化溫度。

圖3 不同溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

2.3.2 pH值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 隨著pH值的升高，皂苷C-K的轉(zhuǎn)化率呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)pH為6.0時(shí)轉(zhuǎn)化率最高（圖4）。微生物的生長(zhǎng)及C-K的合成都有其最適pH范圍，在中強(qiáng)酸或偏堿性的條件下微生物的生長(zhǎng)及C-K的合成受到顯著抑制。

圖4 不同pH值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

2.3.3 菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 如圖5所示，隨著菌液濃度的提高，皂苷C-K轉(zhuǎn)化率逐漸升高，當(dāng)菌液濃度達(dá)到9.0×108cfu/mL時(shí)轉(zhuǎn)化率最高；菌液濃度進(jìn)一步升高，轉(zhuǎn)化率反而下降，可能的原因是菌液濃度過(guò)高，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化出的人參皂苷C-K又被累積的次級(jí)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其它類型的皂苷。

圖5 不同菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

2.3.4 轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的增加，皂苷C-K的轉(zhuǎn)化率不斷升高，在4～6d轉(zhuǎn)化率快速增加，這是由于微生物分泌的酶量逐漸增加從而提高了轉(zhuǎn)化率。6 d后轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)較為平緩，這是因?yàn)榈孜镌碥誖b1被消耗殆盡導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)緩慢（圖6）。

圖6 不同轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

2.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，回歸方程為Y（皂苷C-K含量）=0.220+0.012A-0.019B+4.500×10-3C+6.750×10-3AB-2.500×10-3AC-8.500×10-3BC-4.825×10-3A2-0.031B2-5.575×10-3C2，R2=0.9551。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

回歸模型的方差分析結(jié)果如表4所示。整體模型的P值為0.0006，表明二次回歸方程模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本模型失擬項(xiàng)P值為0.1474，說(shuō)明無(wú)失擬因素存在。該模型決定系數(shù)R2為0.9551，表明該模型的擬合程度良好，試驗(yàn)可信度較高，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可用該回歸方程對(duì)人參皂苷C-K含量進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。影響人參皂苷C-K含量的主次因素為pH值（B）＞菌液濃度（A）＞轉(zhuǎn)化時(shí)間（C），其中A、B、B2的P值均小于0.01，說(shuō)明其對(duì)人參皂苷C-K含量的影響極顯著。

表4 方差分析結(jié)果

對(duì)菌液濃度（A）、pH值（B）及轉(zhuǎn)化時(shí)間（C）3個(gè)因素進(jìn)行交互作用分析，得到交互因素的響應(yīng)面（圖7）。在3個(gè)因素中，因素B和因素C形成的響應(yīng)曲面坡度最為陡峭，交互作用最大；其次為因素A和因素B之間的交互作用；因素C與因素A之間的交互作用最小。但3個(gè)因素中任意兩因素的交互作用對(duì)皂苷C-K含量的影響均不顯著（P＞0.05）。通過(guò)Design Expert 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析確定人參皂苷C-K轉(zhuǎn)化的最佳反應(yīng)條件為菌液濃度8.94×108cfu/mL、pH值6.38、轉(zhuǎn)化時(shí)間7.38 d，該條件下人參皂苷C-K的含量為0.231 mg/mL。考慮實(shí)際操作的可行性，將優(yōu)化的反應(yīng)條件調(diào)整為菌液濃度9.0×108cfu/mL、pH值6.4、轉(zhuǎn)化時(shí)間7.5 d。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在優(yōu)化后的最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到人參皂苷C-K的含量為（0.220±0.02）mg/mL，轉(zhuǎn)化率為78.36%。表明該回歸模型優(yōu)化的反應(yīng)條件可以較好地應(yīng)用于人參皂苷C-K的微生物轉(zhuǎn)化。

圖7 因素間交互作用的響應(yīng)曲面圖

2.4 人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化路徑

如圖8所示，0 h只檢測(cè)出人參皂苷Rb1，6 h后Rb1開(kāi)始轉(zhuǎn)化生成人參皂苷Rd，轉(zhuǎn)化12 h后有少量人參皂苷F2生成。轉(zhuǎn)化24 h后，Rb1的含量明顯減少，并生成少量人參皂苷C-K。隨著轉(zhuǎn)化時(shí)間的延長(zhǎng)，在轉(zhuǎn)化48 h后已檢測(cè)不出人參皂苷Rb1，人參皂苷C-K的含量則不斷增加。因此，確定該菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1為C-K的基本路徑為Rb1→Rd→F2→C-K。

圖8 人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為C-K的路徑分析

3 討論與結(jié)論

人參皂苷作為西洋參中重要的藥用成分，因其糖鏈部分糖基數(shù)目不同而顯示出不同的藥理活性。C-K不是西洋參中天然存在的化合物，因此將西洋參中的主要皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-K具有重要的實(shí)用價(jià)值。本研究從威海市文登區(qū)西洋參種植園采集的西洋參根際土壤中分離菌株，發(fā)現(xiàn)其中有13株菌可以分泌β-葡萄糖苷酶，通過(guò)對(duì)這些菌株進(jìn)行人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，并通過(guò)TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)S’4菌株可以將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-K。其它菌株不能將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-K，可能因?yàn)榫攴置诘摩?葡萄糖苷酶不能轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1；此外，還有可能因?yàn)橛行┚攴置诘郊?xì)胞外的β-葡萄糖苷酶含量較少，七葉苷培養(yǎng)基比較靈敏可以檢測(cè)出來(lái)，而大量的β-葡萄糖苷酶留在了細(xì)胞內(nèi)，需要通過(guò)機(jī)械破碎等方式釋放出來(lái)。通過(guò)對(duì)S’4菌株的16SrDNA測(cè)序及構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，確定該菌株為耐熱科恩氏菌。通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化該菌株轉(zhuǎn)化生成人參皂苷C-K的工藝條件，確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為菌液濃度9.0×108cfu/mL、pH 6.4、轉(zhuǎn)化時(shí)間7.5 d。在該條件下人參皂苷C-K的轉(zhuǎn)化率達(dá)78.36%。該菌株將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為C-K的途徑為Rb1→Rd→F2→C-K。

本研究首次報(bào)道耐熱科恩氏菌可應(yīng)用于人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)篩選的耐熱科恩氏菌可在溫和的反應(yīng)條件下高效地將Rb1轉(zhuǎn)化為稀有皂苷C-K。因此，本研究為稀有皂苷C-K的微生物轉(zhuǎn)化提供了新的菌種來(lái)源，也為C-K的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。