茶樹橙花叔醇合成酶CsNES基因兩個可變剪接轉錄本的功能分析

周漢琛，雷攀登

茶樹橙花叔醇合成酶基因兩個可變剪接轉錄本的功能分析

周漢琛，雷攀登*

安徽省農業科學院茶葉研究所，安徽 黃山 245000

茶樹橙花叔醇合成酶CsNES是催化()-橙花叔醇生物合成的關鍵酶。基于茶樹全長轉錄本及基因組數據分析顯示，橙花叔醇合成酶基因除全長轉錄本外，還存在兩個較短的可變剪接基因亞型。利用5′RACE方法驗證了基因分別在第二、三個外顯子上存在可變的轉錄起始位點，并命名為和。體外蛋白重組顯示，CsNES-2和CsNES-3表達產物均能夠催化底物法尼基焦磷酸FPP生成()-橙花叔醇。基因表達分析顯示，和在花中的表達量較高，在葉片中的表達水平較弱，而在嫩葉中的表達水平顯著高于成熟葉片。在激素GA和MeJA處理下，和能夠被MeJA誘導并上調表達。結果表明，基因存在5′端可變剪接事件，且其可變剪接產物具有催化活性，這為后續研究基因可變剪接機制對茶樹萜類代謝的調控有重要指導意義。

茶樹；橙花叔醇合成酶；可變剪接；功能分析；表達分析

基因的可變剪接廣泛存在于動植物群體中，不僅受個體發育狀態、細胞類型的影響，且環境脅迫能夠顯著影響基因的可變剪接現象[1]?；虻目勺兗艚臃绞街饕袃群颖Ａ簦↖ntron retention，IR）、外顯子跳躍（Exon skipping，ES）、可變5′端剪接位點（Alternative 5′ donor，AD）和可變3′端剪接位點（Alternative 3′ acceptor，AA），其中IR在植物界中廣泛存在，而ES則在動物中廣泛存在[1]。環境脅迫能夠顯著改變無意義mRNAs（Nonsense mRNAs）的積累。擬南芥中的研究顯示，熱脅迫能夠促使基因的一個IR可變剪接基因亞型表達水平發生變化，使其表達水平在特定時間里出現延遲，即逆境條件下植物中的mRNA總豐度可以通過改變功能性mRNAs和無意義mRNAs轉錄的比率來進行調節以抵御逆境[2]。報道顯示，茶樹葉片在干旱脅迫、熱脅迫兩種逆境共同作用下，發生可變剪接的基因數量顯著上升[3]。茶樹脂氧合酶基因可變剪接基因亞型在生物逆境、非生物逆境下均可被誘導表達，而其中的響應機制尚未清楚[4]。隨后研究發現，利用反寡義核苷酸（Antisense oligodeoxynucleotide，AsODNs）抑制茶樹葉片中可變剪接基因亞型1、2和可變剪接基因亞型3的表達后，葉片中順-3-己烯醇的含量呈現下降趨勢，這表明基因可變剪接產物在調節茶樹代謝方面存在潛在機制[5]。茶樹中的芳樟醇合成酶基因通過5′端可變剪接能夠產生兩個基因亞型，其中全長基因亞型含有質體信號肽定位于質體中，能夠促進芳樟醇的合成；較短的可變剪接基因亞型定位于細胞質能夠催化底物合成橙花叔醇[6]。本研究基于已發表的茶樹三代轉錄測序數據[7]，發現橙花叔醇合成酶基因也存在5′端可變剪接現象。

橙花叔醇是一類重要的花香物質，對茶葉的香氣品質形成具有重要貢獻[8]，尤其是烏龍茶[9]。橙花叔醇含有多個同分異構體形態，包括()-橙花叔醇和()-橙花叔醇。目前研究表明，茶樹()-橙花叔醇的生物合成由CsNES[9]或者CsLIS/NES催化[6]。基因在烏龍茶加工過程中隨著搖青次數的增加，其表達水平顯著上調，并證明該基因能夠響應機械損傷帶來的逆境脅迫。低溫脅迫處理顯示，基因表達水平上調，同時茶樹葉片中()-橙花叔醇含量也顯著上升[9]。茶樹揮發性萜類物質多以糖苷形態儲藏在細胞內，近期研究顯示茶樹橙花叔醇葡萄糖苷具有潛在的防御冷脅迫的生物學功能[10]，這表明橙花叔醇不僅積極參與茶樹生長發育，且對茶葉品質形成具有重要影響。因此，本研究對茶樹基因可變剪接亞型是否具有催化功能及其表達模式進行分析，研究結果為可變剪接基因調控茶樹次級代謝產物的后續研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及激素處理

茶樹芽、第一葉、第二葉、第三葉，以及茶花取樣于安徽農業大學農翠園，為7年生舒茶早茶樹。激素處理試驗材料為一年生舒茶早茶籽苗，培養于植物培養室（光照為16?h；溫度為白天25℃、夜晚20℃）；處理時采用10?mmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）或10?mmol·L-1赤霉素（GA）噴施茶樹葉片，1?h后取樣。以上材料均立即置于液氮中速凍，然后放置于–80℃冰箱，用于后續RNA提取、基因定量分析。用于橙花叔醇豐度分析的茶樹葉片于–80℃冷凍干燥48?h，后置于–20℃冰箱保存。

1.2 CsNES基因可變剪接轉錄本的5′RACE驗證

基因可變5′端剪接事件采用5′RACE方法驗證[5]。首先利用Clontech公司SMART 5′ RACE試劑盒合成5′RACE模板，利用表1中的CsNES-R1和CsNES-R2引物進行兩步PCR擴增，擴增酶為TAKARA公司PrimeSTAR高保真酶，擴增程序為：98℃ 10?s，55℃ 15?s，72℃ 20?s，共30個循環。兩輪PCR后利用2.5%瓊脂糖分離克隆產物，純化目的條帶，連接全式金生物公司pEASY-blunt載體后測序。

表1 本研究中所用的引物序列

1.3 原核表達載體構建

驗證基因存在5′端可變剪接位點后，分別設計全長克隆引物（表1）?；谄淙L轉錄本已驗證功能[9]，利用表1中的CsNES-2-PET和CsNES-3-PET引物克隆基因兩個可變剪接基因亞型和，通過酶切位點EcoRI和SalI連接到原核表達載體pET32a中，然后將構建好的質粒轉化Trans-T1，測序結果無誤后轉入大腸桿菌表達菌株BL21中。

1.4 體外酶活驗證

將以上轉入pET32a-CsNES-2、pET32a-CsNES-3質粒的BL21菌株過夜培養，OD600約為0.5時，加入IPTG并使其終濃度為0.5?mmol·L-1，于18℃搖床220?r·min-1誘導10?h，以未加IPTG的菌液為對照[6]。誘導結束后，菌液在6?000?r·min-1轉速下離心10?min，去掉上清液后加1×PBS緩沖液懸浮，然后加入終濃度為1?mmol·L-1的溶菌酶于37℃反應30?min，反應結束后于冰上裂解至澄清。裂解液于轉速5?000?r·min-1下離心10?min，上清液與沉淀分別用PBS緩沖液溶解后，進行SDS-PAGE分析。重組蛋白定量后，添加底物FPP于37℃水浴反應30?min，然后利用65?μm PDMS/DVB SPME萃取頭（Stable Flex，Supelco Inc.，Bellefonte，PA，USA）吸附30?min。吸附結束后，立即將SPME萃取頭于250℃的氣相色譜-質譜中解吸5?min，用于GC-MS分析。

1.5 橙花叔醇豐度分析

橙花叔醇豐度分析參考Han等[11]方法。準確稱取冷凍干燥樣0.2?g于20?mL萃取瓶，加5?mL沸水后置于70℃水浴平衡5?min，然后利用65?μm PDMS/DVB SPME萃取頭于70℃水浴下吸附30?min。吸附結束后，立即將SPME萃取頭于250℃的氣相色譜-質譜中解吸5?min，用于GC-MS分析。

1.6 GC-MS分析

氣相色譜儀Agilent 7697A-質譜儀Agilent 7890A結合色譜柱DB-5（30?m×0.25?mm× 0.25?μm，Agilent）用于橙花叔醇分析，其中氦氣（>99.999%）為載氣。GC運行條件為：初始溫度為50℃并保持1?min，然后以10℃·min-1升至100℃并保持1?min，再以4℃·min-1升高到200℃并保持1?min，最后以16℃·min-1升高到280℃后保持7?min。通過橙花叔醇標準品對試驗中的化合物進行鑒定。

1.7 基因表達分析

1.8 數據統計分析

采用SPSS 19.0軟件對試驗樣品間的差異進行單因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA），其中運算方法為最小顯著性差異法（Least significant difference，LSD），以檢驗不同樣品間的顯著性（<0.05）。

2 結果與分析

2.1 茶樹橙花叔醇合成酶基因CsNES 5′端可變剪接驗證

基于三代全長轉錄數據，以及基因組數據的應用[13]，顯示茶樹橙花叔醇合成酶基因CsNES存在5′端可變剪接事件，即該基因除全長轉錄本外，存在2個較短的可變剪接基因亞型，且轉錄起始位點分別位于第二和第三個外顯子，并命名為和（圖1-A）。利用5′RACE方法共獲得3條序列（圖1-B），測序結果顯示最長序列為全長轉錄本，較短的兩條序列為和（圖1-C）。除去接頭序列，和共相差262個堿基（圖1-C），與全長轉錄本數據結果相一致，以上結果證實茶樹基因存在5′端可變剪接事件。

2.2 茶樹CsNES可變剪接基因亞型的功能分析

基因全長轉錄本翻譯的蛋白序列含有547個氨基酸，其2個5′可變剪接基因亞型分別含有483個和398個氨基酸序列。InterProScan在線網站蛋白結構域分析顯示，CsNES-2和CsNES-3在N-端和C-端均含有萜類合成酶特征結構域IPR001906和IPR034741，以及萜類合成酶特殊的metal-binding結構域IPR005630；利用SWISS-MODEL網站構建蛋白3D模型，結果如圖2-A所示，CsNES-2在N端多出84個氨基酸組成的螺旋結構。通過異源表達，獲得CsNES-2和CsNES-3表達產物（圖2-B）；以FPP為底物，GC-MS分析結果顯示CsNES-2和CsNES-3催化底物FPP生成()-橙花叔醇及少量()-橙花叔醇（圖2-C）。這表明CsNES-2和CsNES-3雖與其全長蛋白序列相比在N-端缺少64個和149個氨基酸序列，但結構分析及體外酶活反應顯示2個可變剪接基因亞型翻譯產物依舊有催化活性（圖2）。

2.3 CsNES-2和CsNES-3的表達模式分析

利用表1中的定量分析引物，對和在茶樹葉片和花中（圖3-A）的相對表達水平進行分析。結果顯示，和均在花中有較高的表達量，兩者在嫩葉中的表達水平顯著高于成熟葉（圖3-B和圖3-C）。通過GC-MS分析茶樹第二葉和花中的揮發性成分，結果顯示茶樹第二葉中橙花叔醇的豐度顯著高于茶樹花中的豐度，這表明茶樹葉片中有更多的橙花叔醇積累（圖3-D）。

注：（A）CsNES基因5′端可變剪接發生位點；（B）CsNES基因5′RACE驗證結果；（C）CsNES基因2個較短可變剪接基因亞型測序結果（其中灰色部分為RACE接頭序列）

本研究分析了不同激素處理下和的表達水平變化，結果顯示和在MeJA激素處理下表達水平顯著上升（<0.05），而GA激素處理后和的表達水平無顯著變化（＞0.05）（圖4-A和圖4-B）。GC-MS分析結果表明，橙花叔醇豐度在MeJA激素處理下顯著增加（<0.05）（圖4-C），而GA激素處理后橙花叔醇豐度有增加但未達到顯著水平（＞0.05）（圖4-C）。

3 討論

植物基因存在廣泛的可變剪接事件，同一個基因可以產生多個轉錄本，尤其是在逆境環境中基因可變剪接的發生普遍存在[14]。植物不僅可以在光的誘導下調控基因的可變剪接[15]，且在不同發育階段也調控了基因可變剪接的發生，比如植物開花進程中基因可變剪接的發生[16-17]。已有研究表明，植物通過基因的可變剪接來增加蛋白質組學的復雜性，且可通過可變剪接減少結構域紊亂蛋白質的產生來適應環境[14]。

茶樹基因存在普遍的可變剪接事件，比如茶樹、基因[4,6]，這些基因的可變剪接產物或通過體外酶活驗證具有催化功能[6]，或通過基因的抑制表達證實了對其催化產物的形成產生影響[4]，表明可變剪接產物具有一定生物學活性。本研究中，茶樹基因通過5′端可變剪接產生2個相對較短的轉錄本，體外酶活證實了2個較短可變剪接轉錄本重組產物能夠催化底物FPP生成橙花叔醇，這表明和具有潛在的生物學功能。后續研究中可通過穩定表達驗證、在茶樹體內是否具有催化活性。

注：（A）CsNES-2, CsNES -3蛋白結構分析；（B）CsNES-2, CsNES-3蛋白重組；（C）GC-MS分析CsNES-2, CsNES-3表達產物的催化活性（其中對照（control）為空載體表達產物與底物FPP反應）

注：圖中F、B、FL、SL、TL分別表示茶樹花、芽、第一葉、第二葉、第三葉；（B）和（C）展示CsNES-2和CsNES-3在茶樹花部位和葉片不同部位中的表達分析，（D）展示茶樹第二葉和花中橙花叔醇豐度分析。圖中不同字母表示0.05水平上差異顯著

注：（A）CsNES-2和CsNES-3；（B）在GA和MeJA處理下的表達分析；（C）激素處理下茶樹葉片橙花叔醇豐度變化分析。圖中不同字母表示0.05水平上差異顯著

表達模式分析顯示，和在花中表達量較高，而橙花叔醇豐度分析顯示其在葉片中有更多的積累。Liu等[6]通過溶劑萃取方法分析茶樹花與葉片中的揮發性成分，也表明葉片中的橙花叔醇含量（75?μg·kg-1）顯著高于花中的含量（7?μg·kg-1）。茶樹橙花叔醇的生物合成可能由多個基因調控，如[6]、[9]以及[18]。報道顯示[6]、[18]均在茶樹花中有較高的表達量。另有研究顯示全長轉錄本在茶樹葉片中的表達水平顯著高于花中的表達水平[19]，這表明全長轉錄本對茶樹葉片中橙花叔醇的積累具有重要作用。

近期研究表明，橙花叔醇合成酶能夠被茶尺蠖（Prout）所誘導表達，并促進了橙花叔醇的生物合成與釋放[18]。[6]、[9]也受MeJA或低溫等脅迫誘導并上調表達。本研究中基因2個較短的可變剪接基因亞型受激素MeJA誘導并上調表達，表明、3表達水平受逆境脅迫影響。此外，MeJA處理后茶樹葉片中的橙花叔醇豐度顯著增加，鑒于茶樹橙花叔醇生物合成涉及多個基因，推測逆境下橙花叔醇合成增加并不是單一基因作用的結果。

綜上所述，茶樹橙花叔醇合成酶基因存在5′端可變剪接事件，能夠產生3個轉錄本，除全長轉錄本具有催化功能外，其2個較短可變剪接基因亞型在離體條件下也具有催化活性。此外，2個較短可變剪接基因亞型受MeJA信號誘導表達，推測其參與了茶樹橙花叔醇的生物合成。本研究結果為后續研究萜類合成酶的可變剪接機制提供了理論基礎。

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The Functional Identification of Two Alternative Splicing Transcripts of

ZHOU Hanchen, LEI Pandeng*

Tea Reasearch Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences, Huangshan 245000, China

CsNES is a key enzyme for the formation of ()-nerolidol in tea plants. According to the analysis of full-length transcriptome and genome data, it is shown thathas two shorter alternative splicing transcripts besides the full-length transcript. The rapid amplification of cDNA ends (RACE) result indicates that theundergoes 5’ alternative splicing in the second and third exons, respectively, which were named asand. The recombinant proteins of CsNES-2 and CsNES-3 possess strong activities to catalyze the FPP into ()-nerolidol and weak activities to hydrolyze FPP into ()-nerolidol. The gene expression analysis shows thatandhad higher expression levels in tea flower compared to those in tea leaves. Their expressions in young leaves were higher than those in mature leaves. Furthermore, the expression levels ofandwere induced by the MeJA treatment. This study identified two alternative splicing transcripts of thegeneand gave insights into the regulation of gene alternative splicing in terpenoids metabolism in.

, nerolidol synthase, alternative splicing, function analysis, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2021)06-753-08

2021-05-08

2021-06-18

國家自然科學基金（32002096）、安徽省農業科學創新團隊（2021YL036）

周漢琛，女，博士，主要從事茶樹生物化學及分子生物學研究。*通信作者：lpteagle@126.com

（責任編輯：趙鋒）