黃瓜細菌性角斑病研究進展

彭月 顧興芳 張圣平 李寶聚 謝學文 薄凱亮 董邵云 苗晗

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜是人們生活中常見的具有豐富營養價值的一種蔬菜，近年來隨著人們對黃瓜的需求量日益增加，設施黃瓜的栽培面積越來越大。早在20 世紀50 年代，我國就有黃瓜細菌性角斑病發生的報道（方仲達和俞大紱，1956），該病害主要發生在東北、華中和華北等地區，病害發生嚴重時，病株率可達到100%，使黃瓜減產大半，甚至絕收。我國對細菌性角斑病的研究起步較晚，尤其是關于黃瓜抗細菌性角斑病的分子生物學研究甚少，本文通過對該病害的國內外研究進展進行綜述，以期為黃瓜細菌性角斑病病原菌鑒定與檢測、抗性鑒定、培育高抗品種等方面提供理論依據。

1 病原菌

1.1 病原菌鑒定

20 世紀80 年代末期，孫福在和何禮遠（1988）對從我國3個不同省市的黃瓜病株上分離出來的病菌進行致病性測定、細菌革蘭氏染色反應、血清學反應和生理生化特性等鑒定，最終確定黃瓜細菌性角斑病是由丁香假單胞菌黃瓜角斑病致病變種（Pseudomonas syringaepv.lachrymans，簡寫為Psl）引起的。而后有學者從黃瓜和甜瓜上分離到細菌性角斑病菌株，經鑒定同為Psl（Kritzman &Zutra，1983；金潛和徐興國，1991）。張吉光等（2010）采用16S rDNA 系統進化的方法再次驗證了黃瓜細菌性角斑病是由Psl引起的，并補充了該病原菌的生物學特性。

伊朗學者Parizi 從兩個地區的黃瓜大棚中分別分離出11 株和14 株黃瓜細菌性角斑病病株，進行細菌學檢測后確定病原菌為Psl，兩個地區分離到的病原菌在表型特征和生化特征上相似，Psl菌株之間的地理來源無相關性（Parizi &Taghavi，2015）。波蘭學者S?omnicka 等（2015a）從不同葫蘆科作物中收集了22 個丁香假單胞菌菌株，其中有9 個來自黃瓜葉片，然后利用多位點序列分型（multi-locus sequence typing，MLST），核糖rDNA 內部轉錄間隔區（internaltranscribed spacer 1，ITS1），細菌基因組重復序列PCR 技術（rep-PCR）等方法進行病原菌分類鑒定，將菌株分為4 個組，經過測序和BLAST 比對后發現，利用MLST 技術進行菌株分組的結果與基于致病性試驗得到的結果較為一致。

孟祥龍（2017）采集了我國6 個省市的樣本，共獲得125 株病原菌，首次發現引起我國黃瓜細菌性流膠病的病原菌有兩種，分別為Psl和胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種（Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense，簡寫為Pcb）。Psl占所有病原菌的66%，是引起黃瓜流膠現象的主要原因，而Pcb會引起黃瓜細菌性莖軟腐病；雖然許多丁香假單胞菌菌株已經被確定，但迄今為止，只有少數幾種致病菌菌株的基因組被測序。S?omnicka 等（2018a）研究了Psl菌株814/98 的基因組序列，發現其基因組大小為6.58 Mb，CG 堿基含量為57.97%。該基因組共鑒定出6 024 個編碼蛋白質的基因和92 個編碼RNA 的基因，發現了3 個特殊的質粒和24 個Ⅲ型效應蛋白。

研究表明Psl除侵染黃瓜外，還可侵染甜瓜、西瓜等，引起葉斑、角斑等癥狀。而在葫蘆科植物中，黃瓜發病癥狀表現最明顯。張昕等（2001）從新疆北部的哈密瓜生產區采集分離純化菌株，發現侵染葉片的病原菌為Psl，但侵染果實的病原菌可能還包括果斑菌（Acidororax avenaesubsp.citrulli），證明侵染葉片和果實的病原菌并不完全是同一個。李亞利（2006）的試驗結果表明甜瓜細菌性葉斑病菌與西瓜細菌性果斑病菌的寄主一致，并且判定在甘肅省河西地區的甜瓜細菌性葉斑病病原菌主要是Psl；高潤蕾（2009）從內蒙古的哈密瓜細菌性葉斑病的葉片上分離菌株，回接后確定其為Psl。上述學者將從瓜類的病葉上分離出的病菌均鑒定為Psl，但后續有其他學者提出不同的見解，代園鳳（2013）發現黃瓜株系和甜瓜株系上的丁香假單胞菌在致病性上存在差異，進行系統發育分析和多重序列比較分析后，證明2 種分離物在遺傳上明顯存在差異，這2 個株系上的致病菌很可能為不同致病變種，建議將甜瓜株系單獨命名為丁香假單胞菌甜瓜致病變種。

1.2 危害癥狀

細菌性角斑病在黃瓜的苗期和成株期均可發病，危害黃瓜的葉片、莖和果實等部位。該病的發病癥狀與霜霉病極其相似，表型鑒定時需仔細辨認。苗期發病時，子葉會出現黃褐色水浸狀的斑點，后期斑點面積逐漸變大連成片，最終導致葉片干枯、幼苗死亡；成株期發病時，葉片初期會出現黃色圓形小斑點，后期圓形斑點由于受葉脈限制而發展成為多角形褐色斑點。濕度大時被害部位產生乳白色菌膿，病斑變透明并在后期嚴重時穿孔，果實表面產生水珠狀菌膿并伴有臭味（Dessert et al.，1982；陳明和趙永波，2010；李寶聚和李煥玲，2012；劉燕妮 等，2018）。

1.3 發病規律

低溫高濕是黃瓜細菌性角斑病發生的主要外界條件。發病及流行的最適環境溫度為15～25 ℃，空氣相對濕度為75%以上；空氣相對濕度越大，病害發生越嚴重。另外水肥灌溉不合理、連作、植株栽植密度過大都會導致病害嚴重發生。病菌可附著在種子表面和內部，播種后子葉直接被侵染；病菌還可從傷口處侵入，從傷口侵入潛伏期短，1 周內就會出現病斑，濕度過大時受害部位產生菌膿。病菌可通過雨水飛濺、昆蟲活動、農事操作等傳播途徑進行重復多次感染（Bhat et al.，2010；李寶聚和李煥玲，2012；劉燕妮 等，2016；劉兆良 等，2017）。

1.4 致病變種的鑒定與檢測

致病變種的鑒定與檢測是一項非常重要的工作，通常需要依據細菌學一系列復雜的理化特征等方法來鑒定。傳統細菌學鑒定方法作為植物病原菌研究的基礎，對于病原菌生理生化、表型等性狀的描述是必不可少的。傳統的病原菌鑒定方法主要有表型分析鑒定（細菌菌落形態鑒定、革蘭氏染色法等）、理化特性測定（氧化酶反應、是否產生熒光色素等）、不同代謝產物的理化鑒定（BLOLOG 鑒定、脂肪酸鑒定）、煙草過敏性反應測定等。之后隨著技術的進步，細菌學的鑒定方法得到了進一步的發展，分子生物學鑒定方法也應用到了丁香假單胞菌的劃分及致病變種的鑒定當中。學者們基于細菌基因組序列（核酸雜交技術、RAPD 技術、RFLP 技術、rep-PCR 技術等）、保守序列基因（16S rRNA 序列分析、ITS 序列分析）、特定致病基因及致病相關基因的PCR 檢測等方法對丁香假單胞菌進行了一系列快速而準確的鑒定，對后續病害診斷及防治有著十分重要的意義（Gardan et al.，1999；焦振泉和劉秀梅，2001；夏明星 等，2005；劉鵬 等，2006；Kvitko et al.，2007；Olczak-Woltman et al.，2007；王哲 等，2011；李寶聚 等，2015a；孔維文等，2016）。

2 黃瓜細菌性角斑病抗性鑒定

植物抗病育種中一項非常重要的工作便是抗病性鑒定，抗源的篩選、后代的選擇、品種的推廣都離不開抗病性鑒定。細菌性角斑病常用的抗病性鑒定方法有苗期人工接種鑒定和田間自然鑒定。由于田間自然鑒定中外界環境條件不可控，因此鑒定結果準確性不高。因此現在多采用苗期人工接種鑒定法，并制定了相應的技術規程和標準。

2.1 苗期接種技術

苗期對抗源材料進行篩選及鑒定，可以提高選擇高抗品種的效率及縮小選擇范圍，加快抗病育種進程。在實施“八五”和“九五”國家攻關計劃的過程中，李淑菊（1999）所在團隊攜手中國農業科學院等其他幾個團隊共同完成了黃瓜上4 種病害的多抗性鑒定技術和8 種病害苗期人工接種抗病性鑒定技術，其中包括細菌性角斑病苗期人工接種鑒定法，即在黃瓜第1 片真葉時期進行噴霧接種，接種濃度為3 × 108cfu·mL-1，接種溫度為23～26 ℃，接種后保持濕度48 h 以上。目前我國黃瓜抗病研究大多采用上述提到的“八五”國家攻關項目統一標準進行苗期接種。

2.2 抗病性調查及評價標準

接種后5～7 d 調查發病情況，調查表型所采用的參考標準不同，得出的結論也有所不同。調查表型時使用的標準主要分為兩類，一類采用0/1評價量表對植物發病癥狀進行劃分，葉片病斑周圍無黃綠色暈圈記為0，即存在抗性；葉片病斑周圍有黃綠色暈圈記為1，即易感。另一類是根據葉片上病斑的數量和大小，采用1～5 級（李樹德，1995）或1～9 級（Olczak-Woltman et al.，2007）評價量表，再依據評價等級計算病情指數，病情指數越低代表品種越抗病。Dessert 等（1982）和Zhang 等（2019）發表的文章中采用第一類作為表型鑒定的標準，Olczak-Woltman 等（2007）和Wang 等（2019）采用的是第二類，而Olczak-Woltman 等（2008）和S?omnicka 等（2018b）則是參考以上兩種標準進行表型鑒定。

3 黃瓜抗細菌性角斑病分子生物學研究進展

3.1 細菌性病害在其他作物上的分子生物學研究進展

細菌性病害是影響我國農業優質高產的一類重要病害，其中造成黃瓜細菌性角斑病的丁香假單胞菌在植物病害上的發生率居于植物細菌性病害之首（Mansfield et al.，2012），可導致菜豆暈疫病、桃樹潰瘍病、十字花科黑斑病、番茄斑點病等病害的發生（王丹丹和王清明，2017）。

糧食作物中由丁香假單胞菌引起的細菌性病害對豆科植物的危害較重，引起大豆細菌性斑點病的病原菌為丁香假單胞菌大豆致病變種（Pseudomonas syringaepv.glycinea），研究表明大豆對該病菌的抗性是由多基因控制的數量性狀遺傳（Ariyarathne et al.，1999）。目前已有學者將大豆細菌性斑點病的抗病基因Rpg1和Rpg4定位到13 號和3 號染色體上（Ashfield et al.，2003）。程偉（2016）利用江淮大豆為試驗材料進行QTL 定位，在13、14 號和18 號染色體上定位到細菌性斑點病的抗性位點。梅宏瑤等（2020）利用野生型大豆為材料，發現了6 個與抗細菌性斑點病相關的QTL 位點，并得到41 個候選基因。豆科植物中細菌性暈疫病的病原也同為丁香假單胞菌。國外學者Miklas 用菜豆作為試驗材料研究細菌性暈疫病，基于連鎖定位的遺傳研究確定了Pv02、Pv04 和Pv10 3 條染色體上主效R基因的位置（Miklas et al.，2009，2011，2014）。Tock 等（2017）構建了3 個重組自交系的連鎖圖譜，并進行GWAS 分析，發現1 個具有廣譜性的主效QTL 位點位于Pv04 染色體上，還檢測到Pv05 染色體上有1 個與菜豆暈疫病密切相關的抗性基因位點。

丁香假單胞菌還是很多果樹、蔬菜病害的致病菌，例如茄科、葫蘆科、十字花科等。番茄細菌性斑點病是由丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringaepv.tomato）引起的（蔡義勇，2007）。Pto抗病基因是1 個在番茄中具有廣譜性的抗性基因（Tang et al.，1999），它位于5 號染色體上（Pitblado et al.，1984），是由Martin 等（1993）采用圖位克隆的方法分離出來的。蔬菜上的細菌性黑斑病主要危害十字花科的油菜、甘藍、蘿卜等，其病原（Pseudomonas syringaepv.maculicola）與番茄細菌性斑點病病原親緣關系最近，采用PCR技術單獨檢測出此變種有一定難度（葉露飛 等，2015；王道澤 等，2016）。另外獼猴桃細菌性潰瘍病是由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonassyringaepv.actinidiae）引起的，其抗性由1 對主效基因控制（易盼盼 等，2015）。李淼等（2009）通過RAPD 技術分析不同獼猴桃品種與細菌性潰瘍病抗性之間的關系，發現抗細菌性潰瘍病材料中都含有1 條大小為1 458 bp 的DNA 片段，而感病材料則沒有這一片段。

3.2 黃瓜細菌性角斑病抗病性遺傳規律研究

關于黃瓜細菌性角斑病抗性遺傳規律研究的報道較少，最早的研究是由Chand 和Walker（1964）發表的，此研究將病害的嚴重程度用受侵染葉片上出現壞死和失綠變黃的病斑的數量和大小來表示，并證明黃瓜細菌性角斑病抗性為多基因控制的數量遺傳。后來Dessert 等（1982）將黃瓜對細菌性角斑病的抗性劃分為抗病和感病2 種類型，抗病型黃瓜葉片上的病斑周圍有很小甚至沒有黃綠色暈圈，而感病型葉片的病斑周圍有黃綠色暈圈，遺傳分析結果表明黃瓜細菌性角斑病抗性是由單個隱性基因控制的。此后數年，在此領域一直未有更進一步的研究報道，直到2008 年，Olczak-Woltman 等綜合前人研究，利用兩組參數再次研究了該病的抗性遺傳規律。他們將鑒定材料分為2 組，第1 組表型劃分方式與Dessert 等（1982）一致，第2 組與Chand 和Walker（1964）一致。試驗結果表明，根據受感染葉片壞死點周圍是否存在黃綠色暈圈，可得出黃瓜細菌性角斑病的抗性是由單個隱性基因控制的；而以黃瓜葉片上病斑的數量和大小作為表型鑒定的標準，通過對F2和回交世代的分析，則證實其抗性是由多基因控制的，抗性遺傳率約為53%，這個結果與上述Chand 和Walker 的研究結果一致（Olczak-Woltman et al.，2008，2009；秦智偉 等，2009）。

由此可見，由于所用研究材料的遺傳背景不同，抗病性鑒定方法不統一，再加上細菌性角斑病病原菌在不同國家和地區可能存在致病性差異，導致目前黃瓜細菌性角斑病的抗性遺傳規律還不甚明確。

3.3 黃瓜細菌性角斑病抗病基因遺傳定位研究

黃瓜細菌性角斑病抗病相關分子標記研究相對滯后，直到近年才有少量報道。Olczak-Woltman于2009 年發現了1 個與細菌性角斑病抗性相關的RAPD 標記OP-AO07，該標記與細菌性角斑病抗性位點之間的遺傳距離約為13 cM（Olczak-Woltman et al.，2009）。S?omnicka 等（2015b）利用Gy14 ×B10 重組自交系群體，用生物信息學方法初步篩選出222 個在親本間有多態性的SSR 標記，并且發現位于5 號染色體上的SSR00398 可能與細菌性角斑病抗性基因有關。金仲恩等（2017）發明了一種用于檢測黃瓜種子中細菌性角斑病菌的分子標記P1、P2 和P3。吳志明等（2019）基于黃瓜細菌性角斑病抗性基因CsPSL的SNP 位點開發了1 個KASP 標記，并申請專利，但關于該基因的具體信息及功能還未見報道。

目前僅有少數研究定位了黃瓜細菌性角斑病抗病相關的基因/QTL 位點，尚未見對該基因進行克隆及分子調控機制研究的報道。S?omnicka 利用Gy14 × B10 重組自交系群體，使用SNP 標記構建包含7 個連鎖群，717 個位點的遺傳圖譜，圖長599.7 cM，平均距離為0.84 cM，最終在5 號染色體上檢測到psl5.1和psl5.2這2 個主效的QTL 位點（S?omnicka et al.，2018b）。Zhang 等（2019）利用抗病親本IL52 與易感親本長春密刺（CCMC）雜交，培育出含155 個株系的F6重組自交系。研究結果表明，在該群體中細菌性角斑病抗性由單隱性位點psl-1控制，并將psl-1定位到1 號染色體的3 118 855～3 951 558 bp 區間。Wang 等（2019）發現Gy14 × WI2757 群體中dm1、cla、psl是同一位點，黃瓜對3 種病害的抗性可能是由同一個基因CsSGR（Pan et al.，2018）控制的，但其分子機制尚未研究清楚。

上述研究對于開展黃瓜細菌性角斑病的分子標記輔助育種奠定了一定的基礎，但是黃瓜細菌性角斑病抗性究竟由多少個基因控制，這些基因的抗病分子機制及其調控網絡還不清楚。

3.4 抗病種質資源篩選與應用

優異抗病種質資源的收集評價是開展抗病育種的前提。早在1997 年，Chen 等就將栽培黃瓜與野生近緣種黃瓜種間雜交得到抗霜霉病的材料IL52，該材料最初被廣泛應用于霜霉病抗性遺傳分析（Chen et al.，1997，2003；Pang et al.，2013）。而后發現IL52 除了有霜霉病抗性外，對白粉病也有高度抗性，可作為兼抗霜霉病和白粉病的黃瓜抗源材料（Zhang et al.，2018）。Zhang 等（2019）從這一發現得到啟發，將IL52 用于細菌性角斑病的研究中，結果發現IL52 對細菌性角斑病也具有抗性，可以作為黃瓜抗病育種的抗源材料。Wang 等（2019）還發現Gy14 對黃瓜霜霉病、細菌性角斑病和炭疽病均具有抗性。馬柏壯等（2013）對222個黃瓜栽培品種進行黃瓜細菌性角斑病人工接種鑒定，發現金滿田黃瓜、綠豐園8 號青瓜和新津春4為高抗品種，另外還從52 份黃瓜種質資源中篩選出13 份高抗材料。

綜上可知，目前雖已對黃瓜細菌性角斑病抗病種質資源進行了一些評價篩選研究，但抗性種質資源在黃瓜中的應用還極為有限，抗細菌性角斑病的黃瓜品種還極為缺乏，因此今后還需不斷加強這方面的研究。

4 黃瓜細菌性角斑病防治方法

黃瓜細菌性角斑病的傳播速度極快，發病較為嚴重。目前對該病害的防治主要以預防為主，在發病前或發病初期采用種子消毒、栽培管理、化學藥劑防治、植物誘導等多種方法進行綜合防治。

4.1 農業防治

農業防治是防治技術中的一個重要組成部分。在播種前用50%醋酸銅溶液對種子進行藥劑消毒，以防種子本身攜帶病菌（何永梅和李榮，2018）；在植株生長過程中做好日常通風排濕，通過覆蓋地膜、小水滴灌等方法進行降濕（黃和喜 等，2018）；同時避免在早晨濕度大時進行整枝打杈、果實采摘等操作，以防止病菌從傷口處侵入（李寶聚 等，2015b）。

4.2 化學防治

化學農藥防治一般用于瓜類蔬菜發病初期，可及時用藥控制病情。防治細菌性角斑病一般選擇銅制劑和抗生素類，如氫氧化銅、春雷霉素和琥珀酸銅等（李寶聚 等，2015b；黃和喜 等，2018）。不同藥劑之間交替使用，起到提高藥效、降低抗藥性風險的作用（陳軍和賈冰峰，2012）。一般選擇在晴天的早上進行施藥，主要噴灑葉片，藥劑中還可適當加入展著劑以提高農藥的附著能力（吳炳芝等，2001）。

4.3 植物誘導抗病

Ku? 于1982 年提出植物誘導抗病性（Ku?，1982），它指的是經外界因子誘導后，植物體內會對有害病原菌產生抗性的現象，細菌、真菌、病毒均可為誘導劑。植物誘導抗病性類似于高等動物的免疫系統，這是一個利用植物自身的防衛來進行病蟲害防治的新途徑，其發展前景十分廣闊。這個方法在已被病蟲害侵染的病株上的效果并不明顯，主要被用來預防病蟲害，使植物得以健康成長。石延霞等（2008）曾用細菌性角斑病病原菌為誘導物，引起抗病信號的傳導，使寄主細胞合成木質素來抵抗病原菌。目前有關植物誘導抗病方面的研究還缺乏深刻認識，需要不斷進行探索和研究。

上述防治方法容易導致農藥殘留、環境污染，且不能徹底切斷病原菌侵染途徑，不能從根本上解決細菌性角斑病對黃瓜生產的危害，只有挖掘優質抗病資源，選育具有細菌性角斑病抗性的新品種，才是最行之有效的辦法。

5 存在問題與未來展望

我國對黃瓜細菌性角斑病的研究起步較晚，近些年來雖有了一些進展，但仍然存在著很多問題：①由于研究者所采用的病原菌接種技術不同，以及進行表型鑒定時采用的抗病性鑒定方法和分級標準存在差異，造成研究結論有所不同；② 在抗性遺傳規律方面的研究不夠深入，黃瓜細菌性角斑病的抗性遺傳規律仍不夠明確，存在一些爭議；③關于黃瓜抗細菌性角斑病基因的連鎖分子標記研究較少，定位區間過大，獲得的標記與目標性狀之間的遺傳距離較遠，缺乏與細菌性角斑病抗性基因緊密連鎖的可靠標記，無法真正用于分子標記輔助育種，并且黃瓜細菌性角斑病抗病反應的分子機制尚不明確。④ 由于抗病性鑒定條件所限，黃瓜細菌性角斑病抗病種質資源鑒定工作缺乏系統性，對材料的抗性研究也不透徹。加之黃瓜的遺傳背景較狹窄，缺乏免疫或高抗的資源，抗性遺傳復雜且是多基因數量遺傳不利于抗性轉育等，這些問題都導致在常規育種中抗病品種選育效率不高。

針對以上問題，可進一步加強以下幾方面的研究：①加強對黃瓜細菌性角斑病苗期接種、表型鑒定及鑒定標準的研究工作，摸索出一套完整、簡便且有效的接種技術及表型鑒定標準；② 廣泛搜集、鑒定抗源材料，拓寬抗病遺傳背景，探索與抗病規律相符的育種方法；利用分子標記、基因工程等手段，深入探究抗病分子機制和抗病規律，加快抗病育種進程，提高育種效率。③利用基因組信息開展抗細菌性角斑病基因的精細定位和基因克隆研究，獲得大量緊密連鎖的可靠標記，建立遺傳連鎖圖譜，實現分子標記輔助選擇與常規育種的有機結合，建立優質多抗基因與其他目標基因抗病育種技術體系。④ 最直接有效且經濟安全的病害防治措施是選育和使用抗病品種。加強抗性材料的篩選與挖掘，關注多抗基因的聚合，將優質高效的抗病基因導入優良品系，為選擇具有復合抗性的黃瓜新品種奠定基礎。