基于Image J軟件對(duì)BALB/c突變卷毛鼠肝腫瘤的定量分析

李曉娟李興杰孫慧偉姜棋予柴燕濤高 蓉李 潤(rùn)李瑞生*湯紫榮

(1.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部,北京 100039;2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心住院與病案管理科,北京 100039)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國(guó)乃至全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率逐年升高,對(duì)我國(guó)公共衛(wèi)生事業(yè)提出了重大挑戰(zhàn)[1]。受到肝癌診斷與臨床治療技術(shù)的限制,大多數(shù)患者直到發(fā)展為進(jìn)展期或晚期才確診,肝腫瘤已呈多發(fā)或彌散性腫瘤病灶,同時(shí)轉(zhuǎn)移與侵襲能力較強(qiáng)[2-3],因此進(jìn)展期肝癌的各項(xiàng)研究逐漸成為了熱點(diǎn)。而動(dòng)物模型在研究過(guò)程中起到非常重要的作用,但目前尚未有最合適的進(jìn)展期肝癌動(dòng)物模型,因此需建立更加直觀且便捷的動(dòng)物模型。同時(shí)在肝癌建模的評(píng)價(jià)中,對(duì)腫瘤定性研究使用較多,對(duì)腫瘤組織等圖片進(jìn)行定量分析則較少見(jiàn)。BALB/c卷毛鼠是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的自發(fā)突變小鼠,前期研究表明突變基因?qū)υ撌蟮母鱾€(gè)系統(tǒng)尤其是免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了一定的影響[4-5]。因此本實(shí)驗(yàn)利用BALB/c突變卷毛鼠與正常BALB/c小鼠構(gòu)建經(jīng)肝門(mén)靜脈注射后形成多發(fā)與彌散的肝腫瘤病灶,利用Image J軟件直觀地對(duì)兩組小鼠的腫瘤病灶比例進(jìn)行定量分析與對(duì)比分析,以期了解突變鼠與正常小鼠在構(gòu)建進(jìn)展期肝癌腫瘤模型之間的差異性,為今后更好得開(kāi)發(fā)和利用本突變鼠作為具有優(yōu)勢(shì)的進(jìn)展期肝癌動(dòng)物模型提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠,3只,SPF級(jí),雌性,6周齡,體重18～20 g;BALB/c小鼠10只,SPF級(jí),雌性,5～6周齡,體重16～18 g,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0002]。BALB/c卷毛鼠10只,SPF級(jí),雌性,5～6周齡,16～18 g,來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室近交培育。動(dòng)物飼養(yǎng)在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(軍)2017-0016]。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷,通過(guò)了解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(IACUC-2017-006)。

1.1.2 細(xì)胞

H22肝癌細(xì)胞株來(lái)自本院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清等購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;吸入性麻醉劑異氟烷購(gòu)自上海玉研科技有限公司;全套解剖手術(shù)器械由本實(shí)驗(yàn)室提供,購(gòu)自上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠;圖像分析軟件為Adobe Photoshop(CS6)和Image J軟件(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院,1.51j8)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

在KM小鼠體內(nèi)腹腔注射復(fù)蘇后的H22細(xì)胞株,待小鼠腹部隆起后,用無(wú)菌注射器抽取腹水,用生理鹽水洗滌后經(jīng)1000 r/min離心(5 min),棄上清液。用生理鹽水將H22肝癌細(xì)胞數(shù)調(diào)整至每毫升1×107個(gè)備用。

1.3.2 構(gòu)建進(jìn)展期肝癌模型

將兩組小鼠依次使用異氟烷進(jìn)行麻醉。在小鼠胸骨下緣正中處開(kāi)一個(gè)1.5 cm的豎形開(kāi)口。將肝葉輕輕擠出并上翻放置于預(yù)置的濕潤(rùn)紗布上,即可清晰地看到與下腔靜脈伴行的肝門(mén)靜脈。使用1 mL滅菌注射器吸取備用細(xì)胞懸液,輕輕扎入肝門(mén)靜脈,緩慢注射。注射體積為100 μL,細(xì)胞量約為1×106個(gè)。注射完畢,輕壓止血后,快速將肝葉置入腹腔內(nèi),縫合消毒傷口。術(shù)后每日觀察兩組小鼠的恢復(fù)狀態(tài),待21 d后采集肝。

1.3.3 利用Image J軟件對(duì)肝彌散病灶進(jìn)行定量分析

選擇獲得的兩組肝組織的最大肝葉,首先拍照獲得垂直視角圖片。進(jìn)而對(duì)拍照所得的肝照片進(jìn)行圖像定量分析,具體分析步驟參考姜棋予等[6]的方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組分析比較,P＜0.05與P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝多發(fā)彌散性腫瘤外觀對(duì)比結(jié)果

結(jié)果顯示:卷毛鼠組和正常小鼠組在相同的造模時(shí)間內(nèi)均形成了多發(fā)性彌散性的肝腫瘤。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)卷毛鼠組的彌散性腫瘤占據(jù)肝的比例顯著多于正常小鼠組,而且觀察到腫瘤與周邊的正常肝組織浸潤(rùn)關(guān)系更加密切(圖1)。

圖1 兩組小鼠肝彌散性腫瘤外觀對(duì)比結(jié)果Figure 1 Comparison of the appearance of liver diffuse tumor between the two groups

2.2 肝多發(fā)彌散性腫瘤病灶圖像定量對(duì)比分析

結(jié)果顯示:首先用Photoshop軟件沿肝邊緣截取得到肝整個(gè)背景圖片(圖2A),再用Image J軟件獲得了圖片的RGB象限分析結(jié)果(圖2B、2C、2D),選擇對(duì)比度相對(duì)高的圖2D進(jìn)行分析。分別獲得了卷毛鼠和正常小鼠肝整體比例圖與肝腫瘤比例圖(圖3)。其中一只卷毛鼠的肝占圖片總面積的37.54%,腫瘤組織占圖片總面積的21.23%(圖3A),而一只正常小鼠肝占圖片總面積的35.19%,腫瘤組織占圖片總面積的11.84%(圖3B)。建立了基于圖像分析軟件Image J的肝照片定量分析方法。

圖2 肝照片的選定及像限分析結(jié)果Note.A,All areas of liver organs were selected.B(Red),C(Blue),D(Green),Analysis results of three RGB image limits.Red arrow shows multiple and diffuse tumors in the liver.Figure 2 Selection of liver photos and results of image limit analysis

圖3 肝總面積和腫瘤病灶識(shí)別預(yù)算定量分析Note.A,Liver ratios(top)and tumor ratios(bottom)in curly mice.B,Liver ratios(top)and tumor ratios(bottom)in normal mice.Figure 3 Quantitative analysis of total area of liver organs and budget of tumor focus identification

2.3 肝多發(fā)彌散性腫瘤比例對(duì)比分析

結(jié)果顯示:兩組小鼠的肝比例不具有顯著性差異,而卷毛鼠的腫瘤比例和腫瘤占肝的比例均顯著大于正常小鼠(P＜0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 兩組小鼠彌散性腫瘤比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of diffuse tumor between the two groups

表1 兩組小鼠彌散性腫瘤比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of diffuse tumor between the two groups

注:與正常小鼠相比,*P＜0.01。Note.Compared with normal mice,*P＜0.01.

?

3 討論

依托實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立肝細(xì)胞癌模型是肝細(xì)胞癌分子靶向治療研究以及分子藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)[7]。近年來(lái)可見(jiàn)利用門(mén)靜脈注射方法構(gòu)建進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性肝癌模型。劉毅等[8]建立肝癌細(xì)胞門(mén)靜脈轉(zhuǎn)移模型,研究發(fā)現(xiàn)部分機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。柴燕濤等[9]利用肝門(mén)靜脈注射不同肝癌細(xì)胞系建立新型進(jìn)展期肝腫瘤模型,為肝癌相關(guān)臨床藥物的篩選奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。同時(shí),研究者更傾向于利用各種成熟的圖像成像技術(shù)來(lái)反映腫瘤的進(jìn)展情況。余琦等[10]利用Image J軟件對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化病變圖像進(jìn)行定量分析,能夠準(zhǔn)確和有效的評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化病變程度。張?chǎng)蔚萚11]利用Image J軟件建立白癜風(fēng)白斑面積的數(shù)字化測(cè)量方法,為臨床客觀評(píng)價(jià)皮損的嚴(yán)重程度及其動(dòng)態(tài)變化提供可靠且簡(jiǎn)便易行的圖形面積數(shù)字化操作流程。而利用門(mén)靜脈注射腫瘤細(xì)胞構(gòu)建自發(fā)突變小鼠進(jìn)展期肝細(xì)胞癌模型,并利用Image J軟件對(duì)腫瘤進(jìn)行觀察的報(bào)道尚未見(jiàn)到。

因此,本研究在前期發(fā)現(xiàn)突變卷毛鼠與正常小鼠構(gòu)建皮下移植和原位肝移植模型之間存在顯著差異的基礎(chǔ)上,應(yīng)用門(mén)靜脈注射腫瘤細(xì)胞構(gòu)建進(jìn)展期肝細(xì)胞癌模型,進(jìn)而對(duì)兩組小鼠的差異性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示:兩組小鼠的肝均形成明顯的彌散性腫瘤。但卷毛鼠組彌散性腫瘤占據(jù)肝的比例顯著多于正常小鼠組,而且腫瘤與周邊的正常肝組織浸潤(rùn)關(guān)系更加密切,與前期其他方式移植腫瘤的研究結(jié)果相一致[12]?，F(xiàn)研究中腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型多采用經(jīng)尾靜脈注射,腫瘤細(xì)胞經(jīng)下腔靜脈回心后經(jīng)由肺動(dòng)脈抵達(dá)肺部[13],難以到達(dá)肝,很難直觀反映與模擬進(jìn)展期肝腫瘤的特性[14-15]。而本實(shí)驗(yàn)選擇經(jīng)肝門(mén)靜脈直接注射腫瘤細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞不僅可隨肝內(nèi)部豐富的血流迅速到達(dá)肝各個(gè)部位,還可長(zhǎng)時(shí)間留駐肝內(nèi)部,尤其在接近肝包膜處毛細(xì)血管豐富,能夠很好形成多發(fā)彌散性的腫瘤病灶。同時(shí)皮下腫瘤和原位腫瘤模型多為單個(gè),可通過(guò)測(cè)量計(jì)算其腫瘤體積進(jìn)行量化分析,獲得照片等圖像信息也較為容易。但對(duì)于多發(fā)性和彌散性腫瘤的量化分析則有難度。曾有研究者以高內(nèi)涵等為代表的圖像采集與分析系統(tǒng),但整個(gè)工作站價(jià)格昂貴,而且對(duì)于圖形文件格式的要求較為嚴(yán)格,因此普及性較差[16-17]。本實(shí)驗(yàn)采用Image J軟件可直觀的對(duì)彌散性腫瘤圖片進(jìn)行定量分析,得出卷毛鼠與正常小鼠肝比例分別為(37.82±1.31)%和(36.21±1.85)%、腫 瘤 比 例 分 別 為(20.43±4.03)%和(9.20±2.01)%、腫瘤占肝比分別為(53.79±9.11)%和(25.35±5.16)%,卷毛鼠與正常小鼠的肝比例不具有顯著性差異,而卷毛鼠的腫瘤比例和腫瘤占肝的比例均顯著大于正常小鼠(P＜0.01),不僅建立了Image J軟件對(duì)彌散性腫瘤進(jìn)行圖像定量分析的方法,而且進(jìn)一步驗(yàn)證了卷毛鼠的肝癌成模能力強(qiáng)于正常小鼠。

綜上所述,BALB/c突變卷毛鼠經(jīng)門(mén)靜脈注射腫瘤細(xì)胞形成多發(fā)彌散性腫瘤的能力優(yōu)于正常BALB/c小鼠,同時(shí)利用Image J軟件對(duì)彌散性腫瘤進(jìn)行定量分析,進(jìn)一步驗(yàn)證了BALB/c突變卷毛鼠在肝腫瘤成模方面的優(yōu)勢(shì)所在,以期該突變卷毛鼠能夠成為開(kāi)展肝癌動(dòng)物模型各項(xiàng)研究的成熟實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。