miR-27a調控PI3K/AKT/mTOR通路介導的自噬對肺炎鏈球菌誘導人肺泡上皮細胞損傷的影響

王艷瓊董利利李 敏張 磊徐沙沙湯 昱

(鄭州大學附屬兒童醫院 河南省兒童醫院 鄭州兒童醫院呼吸科,鄭州 450018)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是一種革蘭氏陽性的胞外細菌,通常是定植在人們口腔和鼻咽部的正常菌群,當機體免疫功能受損時可引起急性感染,是造成社區獲得性肺炎的常見原因,重者可危及生命[1],其在人肺泡上皮細胞(human alveolar epithelial cells,HPAEpiC)中可通過活性氧的過度生成和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的抑制,顯著增加微管相關蛋白輕鏈3(LC3)的表達來激活自噬[2]。而自噬可通過調節炎癥介質的釋放,進一步調控肺泡上皮細胞的損傷[3]。另外,miRNAs是在真核生物中發現的一類內源性的具有基因調控功能的非編碼RNA,其大小長約20～25個核苷酸,其中,miR-27a在細胞生長和發育過程中起關鍵作用[4]。前人研究發現,miR-27a可通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/mTOR信號通路調節骨關節炎中關節軟骨細胞的自噬和凋亡[5],而沉默miR-27a可通過激活脾酪氨酸激酶依賴的mTOR信號通路,調控黑色素瘤細胞自噬和凋亡[6]。但是,目前miR-27a調控PI3K/AKT/mTOR通路對SP誘導HPAEpiC自噬和損傷的影響尚未見報道。因此,本研究使用SP誘導HPAEpiC同時下調miR-27a或過表達/干擾PI3K,觀察其對細胞增殖、凋亡、自噬及PI3K/AKT/mTOR通路的影響,初步探討其分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株和菌株

HPAEpiC(貨號:XY-XB-1271)購自上海烜雅生物科技有限公司;肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,SP;貨號:ATCC 49619),購自上海欣碩生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基,Giboc公司;白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)ELISA試劑盒,上海酶聯生物科技有限公司;RNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司;逆轉錄試劑盒,Genecopoeia公司;雙熒光素酶檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒,索萊寶生物科技有限公司;qRT-PCR檢測試劑盒,上海生工生物科技有限公司;CCK-8試劑盒,濟南遠達晶美生物科技有限公司;野生型和突變型PI3K 3’UTR熒光素酶報告基因載體(PI3K-WT、PI3KMUT)、pcDNA-NC(過表達陰性對照)、pcDNA-PI3K(PI3K過表達載體)、Si-NC(RNA干擾陰性對照)和Si-PI3K(RNA干擾PI3K載體)、miR-27a NC(miR-27a陰性對照)、miR-27a模擬物(miR-27a mimics)、miR-27a抑制物(miR-27a inhibitor)以及miR-27a、U6引物,上海生工生物工程有限公司;Lipofectamine 3000轉染試劑盒,Invitrogen公司;PVDF膜、β-actin鼠抗,Sigma公司;ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒,北京中山金橋生物科技有限公司;PI3K、Beclin1、LC3-I、LC3-II、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、β-actin鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗,Abcam公司;尼康SMZ745光學顯微鏡,上海普赫生物科技有限公司;FACSCanto流式細胞儀,Beckman公司;TL988 qRT-PCR儀,西安天隆科技有限公司;ChemiDoc-MP全能型凝膠成像分析系統,山東三瑞科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養與分組

HPAEpiC使用含10% FBS的RPMI1640培養基(含100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素),置于37℃,5% CO2培養箱中培養,待細胞生長密度達90%左右時,在培養基中加入菌液濃度為1×108CFU/mL的SP誘導損傷[7]。在加入SP誘導前48 h使用Lipofectamine 3000轉染試劑盒分別轉染細胞miR-27a-NC(miR-27a-NC組)、miR-27a-inhibitor(miR-27a-inhibitor組)、pcDNA-NC(pcDNA-NC組)、pcDNA-PI3K(pcDNA-PI3K組),共轉染細胞miR-27a-NC和Si-NC(miR-27a-NC+Si-NC組)、miR-27ainhibitor和Si-NC(miR-27a-inhibitor+Si-NC組)、miR-27a-NC和Si-PI3K(miR-27a-NC+Si-PI3K組)、miR-27a-inhibitor和Si-PI3K(miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組)。另取非誘導細胞為對照組,誘導且未轉染細胞為誘導組。

1.3.2 qRT-PCR檢測正常HPAEpiC和SP誘導的HPAEpiC中miR-27a表達水平

RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA,逆轉錄試劑盒得到cDNA,以cDNA為模板,按照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR反應體系、設定反應條件。以U6作為內參,根據2-ΔΔCt算法計算miR-27a表達水平,miR-27a正、反向引物為5’-TCCGTGAGAGC TGGAAAACC-3’、5’-TGGTTCTAACTAACTCCAGCC G-3’、U6正、反向引物為5’-GACGGCTTCCCAATAA CAG-3’、5’-ATTGAGGCTTCAGCACCAC-3’。

1.3.3 生物信息學預測和雙熒光素酶驗證miR-27a和PI3K的靶向關系

采用TargetScan在線網站(http://www.targetscan.org/)對miR-27a和PI3K的結合位點進行分析。取對數生長期的HPAEpiC接種于96孔板,常規培養24 h后,將細胞分為miR-27a-mimics+PI3K-WT組、miR-27a-NC+PI3K-WT組、miR-27amimics+PI3K-MUT組和miR-27a-NC+PI3K-MUT組,每組設6個復孔,使用Lipofectamine 3000轉染試劑盒進行細胞共轉染。轉染48 h后,按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性,驗證miR-27a與PI3K的靶向關系。

1.3.4 CCK-8法檢測各組細胞增殖活性

收集各組細胞,每孔100 μL接種至96孔板中,加入濃度為10%的CCK-8溶液,繼續培養2 h后,于酶標儀上測定各孔在450 nm波長下的OD值,細胞增殖率(%)=(實驗組OD450nm-空白組OD450nm)/(對照組OD450nm-空白組OD450nm)。

1.3.5 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率

收集各組細胞,1200 r/min離心5 min,棄培養基,參照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.3.6 ELISA檢測各組細胞上清液中IL-6和IL-10含量

每組各取約2 mL細胞懸液,1200 r/min離心10 min,取上清,嚴格按照IL-6和IL-10 ELISA試劑盒說明書進行檢測,每組設置6個重復。

1.3.7 Western blot法檢測各組細胞中PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相關蛋白表達水平

收集各組細胞,使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量,依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉、1∶2000濃度稀釋后的PI3K、Beclin1、LC3-I、LC3-II、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、β-actin鼠抗4℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5000)中室溫孵育2 h,用ECL顯色試劑盒顯色,以β-actin內參,全能型凝膠成像分析系統分析蛋白表達水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析,計量資料以平均數±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗;P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 正常和SP誘導的HPAEpiC中miR-27a及PI3K蛋白表達水平

與對照組miR-27a(1.00±0.00)、PI3K蛋白(0.84±0.09)相比,誘導組細胞中miR-27a表達水平(1.73±0.18)升高(P＜0.05),PI3K蛋白表達水平(0.29±0.03)降低(P＜0.05)。見圖1。

圖1 對照組和誘導組PI3K蛋白表達圖Figure 1 PI3K protein expression in control group and induction group

2.2 下調miR-27a或過表達PI3K對SP誘導HPAEpiC增殖、凋亡及炎性因子影響

與對照組相比,誘導組miR-27a表達水平、細胞凋亡率、IL-6含量升高(P＜0.05),PI3K蛋白水平、細胞增殖率和IL-10含量降低(P＜0.05);與miR-27a-NC組相比,miR-27a-inhibitor組miR-27a表達水平、細胞凋亡率、IL-6含量降低(P＜0.05),細胞增殖率和IL-10含量升高(P＜0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-PI3K組細胞凋亡率、IL-6含量降低(P＜0.05),PI3K蛋白水平、細胞增殖率和IL-10含量升高(P＜0.05)。見圖2、表1。

表1 各組細胞增殖、凋亡及炎性因子含量比較(n=6)Table 1 Proliferation,apoptosis and inflammatory factor content of each group

圖2 各組細胞凋亡檢測圖Figure 2 Apoptosis detection of each group

2.3 下調miR-27a或過表達PI3K對SP誘導HPAEpiC中Beclin1、LC3-I、LC3-II、AKT、mTOR蛋白表達影響

與對照組相比,誘導組、miR-27a-NC組和pcDNA-NC組細胞Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值升高(P＜0.05),AKT、mTOR蛋白磷酸化水平降低(P＜0.05);miR-27a-inhibitor組細胞Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值降低(P＜0.05),AKT、mTOR蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05);與pcDNANC組相比,pcDNA-PI3K組細胞Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值降低(P＜0.05),AKT、mTOR蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組細胞自噬相關蛋白及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平比較Note.Compared with the control group,aP＜0.05.Compared with the miR-27a-NC group,bP＜0.05.Compared with the pcDNA-NC group,cP＜0.05.Figure 3 Autophagy related proteins and phosphorylation levels of AKT and mTOR proteins of each group

2.4 miR-27a和PI3K基因靶向關系的預測與驗證

生物信息學預測結果顯示,miR-27a序列上存在與PI3K3’UTR結合的連續位點。與miR-27a-NC+PI3K-WT組(1.00±0.00)相比,miR-27a-mimics+PI3K-WT組(0.37±0.04)熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05),而miR-27a-NC+PI3K-MUT組(0.95±0.10)和miR-27a-mimics+PI3K-MUT組(1.03±0.11)熒光素酶活性無明顯變化。見圖4。

圖4 生物信息學預測miR-27a和PI3K3’UTR結合位點Note.WT,Wild-type.MUT,Mutant-type.UTR,Untranslated region.Figure 4 Bioinformatics prediction of miR-27a and PI3K3’UTR binding sites

2.5 下調miR-27a和干擾PI3K對SP誘導HPAEpiC增殖、凋亡及炎性因子含量的影響

與miR-27a-NC+Si-NC組相比,miR-27a-inhibitor+Si-NC組細胞增殖率和IL-10含量升高(P＜0.05),細胞凋亡率和IL-6含量降低(P＜0.05);miR-27a-NC+Si-PI3K組細胞增殖率和IL-10含量降低(P＜0.05),細胞凋亡率和IL-6含量升高(P＜0.05)。miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組細胞增殖率和IL-10含量較miR-27a-inhibitor+Si-NC組降低(P＜0.05),較miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組升高(P＜0.05),細胞凋亡率和IL-6含量較miR-27a-inhibitor+Si-NC組升高(P＜0.05),較miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組降低(P＜0.05)。見圖5、圖6。

圖5 各組細胞增殖、凋亡及炎性因子含量比較Note.Compared with the miR-27a-NC+Si-NC group,aP＜0.05.Compared with the miR-27a-inhibitor+Si-NC group,bP＜0.05.Compared with the miR-27a-NC+Si-PI3K group,cP＜0.05.Figure 5 Proliferation,apoptosis and inflammatory factor content of each group

圖6 各組細胞凋亡檢測圖Figure 6 Apoptosis detection of each group

2.6 下調miR-27a和干擾PI3K對SP誘導HPAEpiC的蛋白表達影響

與miR-27a-NC+Si-NC組 相 比,miR-27ainhibitor+Si-NC組細胞Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值降低(P＜0.05),AKT和mTOR蛋白磷酸化水平升高(P＜0.05);miR-27a-NC+Si-PI3K組細胞Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值升高(P＜0.05),AKT和mTOR蛋白磷酸化水平降低(P＜0.05)。miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組細胞Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值較miR-27a-inhibitor+Si-NC組升高(P＜0.05),較miR-27a-NC+Si-PI3K組降低(P＜0.05),AKT和mTOR蛋白磷酸化水平較miR-27a-inhibitor+Si-NC組降低(P＜0.05),較miR-27a-NC+Si-PI3K組升高(P＜0.05)。見圖7。

圖7 各組細胞自噬相關蛋白及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平Note.Compared with the miR-27a-NC+Si-NC group,aP＜0.05.Compared with the miR-27a-inhibitor+Si-NC group,bP＜0.05.Compared with the miR-27a-NC+Si-PI3K group,cP＜0.05.Figure 7 Autophagy related proteins and phosphorylation levels of AKT and mTOR proteins of each group

3 討論

細菌性肺炎每年可造成多達200萬人死亡,最常見的肺炎病原體是肺炎球菌和SP,約占社區獲得性肺炎的半數,醫院獲得性肺炎的3%～10%[8],對人類健康造成嚴重威脅。劉煌等[9]研究發現SP感染肺泡上皮細胞后,IL-10含量顯著降低,IL-6含量顯著升高,引起炎癥反應且使肺泡上皮細胞凋亡。本研究參照王勇等[7]方法,用1×108CFU/mL SP誘導HPAEpiC,發現細胞凋亡率、IL-6含量顯著升高,細胞增殖率、IL-10含量顯著降低,與劉煌等[9]一致,表明模型制備成功。本研究還發現,誘導細胞中miR-27a表達水平、Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值顯著升高,PI3K蛋白表達及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低,提示SP誘導HPAEpiC損傷與miR-27a和PI3K/AKT/mTOR通路密切相關。

miR-27a對調節多態性、腫瘤發生、細胞增殖、凋亡及血管生成中發揮重要作用。miR-27a水平增加可導致細胞周期阻滯,抑制人少突膠質細胞增殖[10]。而敲低miR-27a-3p可通過增加人臍帶靜脈內皮細胞的狹縫引導配體2表達來抑制脂多糖誘導的損傷[11]。miR-27a上調還可引起糖尿病腎病中足細胞損傷[12]。本研究發現,抑制miR-27a可提高SP誘導的HPAEpiC增殖率、IL-10含量、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平,降低miR-27a表達水平、細胞凋亡率、IL-6含量、Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值,其中Beclin1和LC3-II/I為自噬標志物,可用于反映自噬強度[13],提示抑制miR-27a,可能通過抑制細胞凋亡及自噬,緩解SP誘導的HPAEpiC損傷。但miR-27a是否通過調控PI3K發揮作用,尚需進一步研究。

PI3K參與多種細胞功能,可與AKT結合,磷酸化AKT的Ser308致使AKT活化,AKT通過下游多種途徑對靶蛋白進行磷酸化而發揮抗凋亡作用。PI3K/AKT/mTOR信號通路與自噬密切相關[14]。本研究發現,過表達PI3K可提高SP誘導的HPAEpiC增殖率、IL-10含量、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平,降低細胞凋亡率、IL-6含量、Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值,提示過表達PI3K,可能通過抑制細胞凋亡及自噬,緩解SP誘導的HPAEpiC損傷。Zeng等[15]研究發現4苯基丁酸能夠上調急性肺損傷模型中AKT/mTOR通路,抑制自噬,緩解LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷,與本研究結果一致。然而,Du等[16]研究發現蛋白酶激活受體-2能夠通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,抑制自噬,從而引發腎小管上皮細胞炎癥,另有研究發現抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,可通過促進自噬,減輕動脈粥樣硬化病變斑塊的形成[17]。這與本研究并不一致,這可能是由于自噬過程較快,而且細胞既可通過提高自噬減少細胞壞死,減輕有毒物質的積累,又可通過主動降低自身自噬活性,減少因自噬引起的細胞死亡,并且來自于外界的多種刺激條件及環境因素各不相同[18],所以不同細胞和組織間的自噬活性存在一定的差異性。早期Liu等[19]研究發現miR-27a通過靶向PI3K調控髓核細胞凋亡。本研究通過生物信息學預測及雙熒光素酶實驗驗證發現,miR-27a和PI3K存在靶向關系,將miR-27a-inhibitor和Si-PI3K共轉染SP誘導HPAEpiC,發現miR-27a-inhibitor+Si-PI3K組細胞增殖率、IL-10含量、Beclin1蛋白表達水平和LC3-II/I比值較miR-27a-inhibitor+Si-NC組降低,而細胞凋亡率、IL-6含量、AKT和mTOR蛋白磷酸化水平升高,提示抑制miR-27a表達對SP誘導HPAEpiC損傷的緩解作用,可被干擾PI3K逆轉。

綜上所述,在SP誘導HPAEpiC損傷過程中,miR-27a表達上調,而抑制miR-27a可靶向上調PI3K蛋白表達,激活其下游AKT/mTOR信號通路,進而抑制細胞自噬,緩解SP所致HPAEpiC損傷。但是,關于miR-27a的靶基因較多,是否還涉及其它信號通路,尚需深入研究。