FIRS早產兒臍血MMP-9、TIMP-1水平變化及其與肺損傷關系的研究

閆祎煒江 蓮李 梅張會芬沈 穎張文浩張文婷

(河北醫科大學第四醫院兒科,石家莊 050000)

隨著早產兒診治水平不斷提高,早產兒的數量及存活率逐年提升,新生兒中早產兒發生率為7.8%,其中出生體重小于1500 g占32.3%,而呼吸系統并發癥的發生率為52.3%[1]。支氣管肺發育不良(bronchopulmonory dysplasia,BPD)是早產、高氧損傷、機械通氣、感染等多種因素綜合作用引起的一種氧依賴疾病,是影響早產兒預后的重要因素,目前其發病機制尚未完全明確。研究表明,胎兒炎癥反應綜合征(fetal inflammatory response syndrome,FIRS)與BPD明顯相關,是不良新生兒結局的重要因素[2]。但是,FIRS能否確切導致BPD的發生機制尚不明確。尚有研究表明,FIRS介導的炎性細胞因子會明顯上調基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)的表達水平[3]。而高氧[4]、機械通氣[5]等因素導致的BPD模型中亦存在MMP-9水平升高。本研究通過臨床研究及動物實驗以探討FIRS介導MMP-9誘發BPD的具體機制,為臨床治療提供新的靶點并發掘早期預測指標。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究人群

納入2018年5月～2019年12月于河北醫科大學第四醫院出生的早產兒共118例,其中男性66例,女性52例,胎齡分布27+6周～36+5周,出生體重分布900～3600 g(表1)。依據胎齡及FIRS診斷標準進行分組,FIRS主要診斷指標[6]:早產兒臍血IL-6＞11 pg/L,羊水CRP＞6 mg/L,胎盤和(或)臍帶病理存在炎性浸潤,羊水涂片可見炎性細胞聚集;輔助診斷指標:產婦發熱、心率＞100次/分,胎心＞160次/分,子宮壓痛,羊水嗅臭,外周血白細胞計數每升＞15×109個。對照組1(胎齡≤32周,非FIRS),n=25;對照組2(32周＜胎齡＜37周,非FIRS),n=32;研究組1(胎齡≤32周,FIRS),n=33;研究組2(32周＜胎齡＜37周,FIRS),n=28。排除母親分娩前存在妊娠合并非感染疾病、分娩過程中出現窒息缺氧以及合并者其他系統嚴重疾病患兒。

1.1.2 觀察指標

留取斷臍后早產兒端臍靜脈血(2 mL)及胎盤組織。檢測臍血中的白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP-1)、MMP-9水平。制備胎盤組織切片觀察胎盤病理改變?；純弘S訪至28 d,明確是否發生BPD結局。

1.1.3 實驗動物

本實驗使用45只清潔級10周齡昆明小鼠購自河北醫科大學實驗動物中心[SCXK(冀)2018-004],其中雄鼠15只,體重35～40 g,雌鼠30只,體重30～35 g。小鼠飼養于河北醫科大學第四醫院動物實驗中心[SYXK(冀)2018-001],實驗方案經河北醫科大學第四醫院實驗動物倫理委員會審核通過(1ACUC-4thHos Hebmu-2019006),并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

人IL-6、MMP-9、TIMP-1、ELISA試劑盒購自艾萊薩生物科技有限公司(中國);維甲酸購自山東良福制藥;脂多糖購自Sigma公司;C-反應蛋白測定試劑盒購自上海捷門生物技術公司(中國);瑞姬氏染色液購自溫州康泰生物科技公司(中國);YXI-2離心機購自三洋公司(日本);全自動酶標檢測儀(VERS Amax,美國);全自動洗板機購自Sigma公司(Aw1,美國);-80℃超低溫冰箱購自SANYO公司(日本);電熱恒溫水浴箱購自上海森信實驗有限公司(JY-17-1,中國);高精度加樣器及槍頭購自BBI公司(加拿大);顯微鏡購自OLYPUS公司(CX-21,日本);特定蛋白分析儀購自OLYPUS公司(Au2700,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備與分組

飼養1周后將雌雄小鼠按2∶1合籠,次日清晨觀察到陰栓的雌鼠視為懷孕第1天。參照Rounioja等[7]制備FIRS小鼠模型(圖1),將孕鼠隨機分為3組,每組各10只,FIRS(lipopolysaccharide,LPS干預)組、維甲酸(retinoic acid,RA干預)組、生理鹽水(normal saline,NS干預)組,孕15 d時LPS及RA組羊膜囊內注射LPS,總量不超過100 μg/kg,NS組予等量NS羊膜囊注射,密切觀察孕鼠生命活動,注意有無感染、陰道流血流液及流產征象,RA組小鼠在孕17 d開始RA灌胃,劑量50 μg/kg,至分娩,將剖宮產及順產娩出的胎盤進行病理檢查,胎盤組織存在炎性浸潤則認為制模成功。本研究流產率10.00%,建模成功率為83.73%。

圖1 FIRS小鼠建模流程Note.A,Observation of the formation of vaginal suppository.B,In the 15th trimester of pregnancy,the amniotic sac was exposed by laparotomy,then the abdominal cavity was sutured after lipopolysaccharide injection.C,Pregnant mice were normal after drug injection.D,Pregnant mice were normal in birth.E,A large number of inflammatory cells were infiltrated in the placental tissue(HE)after delivery,and the villous structure disappeared,and edema and partial fibrosis were observed,and the modeling was successful.F,Normal placental tissue(HE).Figure 1 FIRS mice modeling process

1.3.2 標本收集

隨機取3組3只孕19 d孕鼠,行剖宮產手術,留取胎鼠的胎盤、肺組織,余孕鼠待自然分娩,分別于產后1、3、7、14 d處死仔鼠(每個時間點每組n=10),均留取肺組織。

1.3.3 觀察指標測定

采用Real-time PCR法測定肺組織MMP-9、TIMP-1表達水平,HE染色觀察胎盤、肺組織病理改變。

1.4 統計學方法

所有數據通過SPSS(21.0,IBM Support Forum)及GraphPad Prism(v8.2.1.441,San Diego,CA 92108)軟件進行分析,以平均數±標準差(±s)表示,計量資料采用t檢驗比較,多組均數的比較采用重復測量方差分析,相關性分析采用Spearman’s線性相關。計數資料兩組資料比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 一般資料

兩組患者在胎齡、性別、出生體重和Apgar評分均無顯著差異(P＞0.05)(表1)。

表1 一般資料Table 1 General characteristic

2.2 早產兒臍血中IL-6、MMP-9和TIMP-1表達水平

與對照組相比,同胎齡FIRS組IL-6、MMP-9、TIMP-1水平及M/T比值顯著增加(P＜0.01)。在FIRS1組和FIRS2組之間,IL-6、MMP-9和TIMP-1的水平以及M/T比值無顯著差異(P＞0.05)。對照組2中IL-6水平與對照組1中比較無顯著差異(P＞0.05)。對照組2中MMP-9和TIMP-1的水平顯著升高,而M/T比值顯著降低(P＜0.01)(表2)。

表2 不同組別臍血IL-6、MMP-9、TIMP-1、M/T比值水平比較Table 2 Levels of IL-6,MMP-9,TIMP-1 and M/T ratio in different groups

2.3 IL-6與MMP-9、TIMP-1和M/T比值之間的相關性

IL-6與MMP-9和TIMP-1及M/T的比例呈正相關(PMMP-9＜0.01,rMMP-9=0.58;PTIMP-1＜0.01,rTIMP-1=0.45;PM/T＜0.01,rM/T=0.44)(圖2)。

圖2 早產兒IL-6和MMP-9、TIMP-1及M/T比值之間的相關性Figure 2 Correlation between IL-6 and M/TMP-9,TIMP-1 and M/T ratio in preterm infants

2.4 早產兒胎盤組織的組織學檢查

對照組(圖3A)胎盤組織無明顯病理改變,絨毛膜羊膜炎病變多集中在絨毛膜部位,可見炎細胞浸潤(圖3B)。此外,急性炎癥組織呈現炎性細胞浸,伴組織充血及水腫(圖3C)。

圖3 胎盤組織(HE染色)Note.A,Normal placental tissue showed no obvious pathological changes.B,Chorionic tissue showed mild inflammatory cell infiltration.C,Acute inflammatory placental tissue showed congestion and edema,aggregation of neutrophils.Figure 3 Placental tissue(HE staining)

2.5 疾病結局

FIRS組BPD發生率高于同胎齡對照組(P＜0.05)(表3)。

表3 不同組中BPD發生率的比較Table 3 Incidence of BPD in different groups

2.6 仔鼠肺組織病理改變

程度明顯減輕(圖4)。

2.7 不同日齡FIRS鼠肺組織IL-6、MMP-9、TIMP-1表達水平

NS組為正常肺組織(圖4A1～D1)RA組(圖4A3～D3);FIRS組肺泡數目減少(圖4A2～D2),肺泡間隔減少、增厚,間質部分及肺泡內可見少量出血,部分肺泡結構破壞;RA組與FIRS組病變相似,

圖4 肺組織(HE染色)Note.A1～D1,Lung tissue of mice in the control group at 19 days of gestation,1,7 and 14 days after delivery.A2～D2,Lungs of mice in the control group at 19 days of gestation,1,7 and 14 days in the FIRS group tissue.A3～D3,Lung tissue of mice in the control group of RA group at 19 days gestation,1,7 and 14 days postpartum.Figure 4 Lung tissue(HE staining)

FIRS組:19日齡胎鼠及1、7、14日齡新生鼠IL-6、MMP-9、TIMP-1表達水平及M/T比值均明顯高于同日齡對照組(P＜0.01)。RA干預后:19日齡胎鼠及1、7、14日齡新生鼠IL-6、MMP-9、TIMP-1表達水平及M/T比值仍明顯高于同日齡對照組(P＜0.01),但該日齡胎鼠及新生鼠IL-6、MMP-9、TIMP-1表達水平及M/T比值則明顯低于同日齡FIRS組(P＜0.01)(表4)。

表4 不同日齡各組胎鼠/新生鼠肺組織IL-6、MMP-9、TIMP-1、M/T比值表達水平的比較(n=8)Table 4 Expression of IL-6,MMP-9,TIMP-1,M/T ratio of lung tissue of different groups in different time points

2.8 FIRS鼠肺組織IL-6與MMP-9、TIMP-1及M/T的相關性分析

小鼠肺組織中IL-6與MMP-9(PMMP-9＜0.01,rMMP-9=0.741)、TIMP-1(PTIMP-1＜0.01,rTIMP-1=0.677)及M/T呈正相關(PM/T=0.02,rM/T=0.410)(圖5)。

圖5 小鼠IL-6和MMP-9,TIMP-1以及M/T比值之間的相關性Figure 5 Correlation between mice IL-6 and MMP-9,TIMP-1 and M/T ratio

3 討論

早產是致使胎兒臟器發育不完全最重要的病因,據報道,早產與FIRS密切相關[8]。Helmo等[9]研究表明IL-6(＞11 pg/mL)是導致重大新生兒發病的獨立危險因素。Rangel-Frausto等[10]通過檢測胎兒臍血細胞因子變化,結果顯示胎兒早產前IL-6水平明顯升高。而通過IL-6、IL-1β和TNF-α介導的炎癥反應會刺激MMP的分泌[11-12],其中MMP-9是白細胞分泌的4型膠原酶,與胎膜損傷有關[13]。在本研究中,出現FIRS的新生兒臍帶血中IL-6、MMP-9、TIMP-1水平及M/T的比值明顯增加,且IL-6水平與MMP-9和TIMP-1水平以及M/T比值呈正相關。而上述炎性指標對FIRS具有一定的診斷價值,是預測BPD發生率的有效指標。

此外,筆者對胎齡的因素影響進一步探討。既往研究報道,MMP-9水平似乎與胎齡有關,未發生BPD的早產兒中,在妊娠33～36周時觀察到最高水平,而足月新生兒中TIMP-1水平最高[14]。Bednarek等[15]報道,早產兒的MMP-9水平和胎齡也明顯相關。本研究結果發現,對照組2中MMP-9和TIMP-1的水平高于對照組1。但是,對照組2的M/T比值低于對照組1。同樣,FIRS組2中的M/T比值略低于FIRS組1。提示M/T比值與胎齡呈負相關,這可能和胎齡增加肺部發育逐漸成熟相關。

尚有研究表明,BPD早產兒體內的MMP-9和TIMP-1的水平明顯上調[14-15]。在本研究中,FIRS組1的BPD損傷的發生率均高于對照組1。但是,FIRS組2和對照組2的BPD發生率無顯著差異,這些結果表明BPD可能與胎齡也存在密切相關。Mittendorf等[16]報道的結果表明胎齡和低出生體重可能是BPD的主要風險,和本研究結果一致。此外,本研究還發現FIRS組1的BPD發生率高于FIRS組2。表明MMP-9和TIMP-1的水平與胎齡結合可能是預測BPD發生的更為精確的指標。Fukunaga等[17]進行的一項臨床研究結果顯示,在胎齡30周的嬰兒中,臍帶血中M/T的比例與BPD的發生明顯相關,該研究結果和本研究一致。

此外筆者在小鼠動物模型中驗證了FIRS介導MMP-9上調誘發BPD的相關性并探討了藥物治療的可行性。建模成功后,小鼠胎盤病理顯示FIRS模型的胎盤組織可見大量炎細胞浸潤,絨毛結構消失,組織水腫及部分纖維化。本研究結果顯示FIRS組小鼠可見IL-6、MMP-9、TIMP-1及M/T明顯高于對照組,而MMP-9抑制劑組可見炎癥指標明顯降低,且上述炎癥指標變化趨勢呈明顯正相關。上述結果和臨床研究結果相一致。Chang等[18]進行的一項動物實驗結果顯示:M/T比值在BPD的進程中起著重要作用,并且觀察到4-苯甲酸、卟啉氯化物、維甲酸可以有效降低大鼠模型中M/T比值,并減少BPD的發生,其結果和本研究相似。

綜上,FIRS可通過釋放IL-6,調節MMP-9、TIMP-1水平及M/T比值,介導BPD發生,應用MMP-9抑制劑可在肺損傷過程中發揮保護作用,為臨床治療提供了潛在的藥物治療靶點。