枸杞多糖與UCA1 siRNA單用或合用對MPP+誘導帕金森病細胞模型的干預作用及機制研究

王立俠韓金芬

(1.鄭州市第七人民醫院神經電生理室,鄭州 450000;2.新鄉醫學院第三附屬醫院兒內科,河南 新鄉 453003)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種神經退行性疾病,多發于老年群體,目前發病機制尚未完全清楚[1]。有研究表明,細胞凋亡、線粒體功能障礙、氧化應激等多種因素參與了帕金森病的病 理 機 制[2-3]。枸 杞 多 糖(Lycium barbarumpolysaccharide,LBP)是從枸杞中提取出來的一種水溶性多糖,具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤等多種功能[4-5]。有研究顯示,枸杞多糖可降低帕金森小鼠中腦氧化應激損傷及對黑質致密部DA能神經元起保護作用[6];枸杞多糖可通過ROS-NO途徑降低6-OHDA誘導PC12細胞凋亡[7]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)尿路上皮癌相關轉錄本1(urothelial cancer associated 1,UCA1)基因定位于19p13.12染色體,其表達高度體現在心臟、子宮和膀胱的胚胎發育過程中。目前UCA1在帕金森病中的研究較少,有研究顯示,lncRNA UCA1可通過調控SNCA促進帕金森病進展[8]。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)可通過增強氧化應激及損傷線粒體兩種方式選擇性破壞中腦黑質多巴胺能神經元,目前廣泛用于建立帕金森病實驗模型[9]。本研究使用MPP+誘導人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y建立帕金森病體外細胞模型,旨在研究枸杞多糖及lncRNA UCA1單獨或聯合對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡保護作用及可能的分子機制,為帕金森病的治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞

人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y購自美國ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗均購自美國Gibco公司;枸杞多糖(由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖成分組成;純度≥50%)購自上海源葉生物科技有限公司;MPP+、MTT及DMSO均購自美國Sigma公司;Annexin VFITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒、PCR試劑盒、LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司;2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)活性氧檢測試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自中國碧云天生物技術研究所;Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax抗體均購自美國Abcam;酶標儀(550型)購自美國Bio-rad公司;流式細胞儀(FACSCanto II型號)購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

細胞使用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺及1%抗生素的DMEM培養基,放置于37℃、5%體積分數CO2、飽和濕度的培養箱培養。倒置顯微鏡下定期觀察細胞生長狀態,細胞貼壁80%～90%達到對數生長期時,胰酶消化細胞,按照1∶3傳代。選擇生長狀態良好的第3代對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2 MPP+及枸杞多糖作用濃度的篩選

以5×103個/孔接種生長至對數期的SH-SY5Y細胞于96孔板,于37℃、5%體積分數CO2培養箱中培養24 h,使用MPP+(終濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L的MPP+處理細胞24 h)、枸杞多糖(50、100、200、400 μg/mL的枸杞多糖[7]預處理細胞1 h后加MPP+繼續處理24 h),設置僅加入等體積培養基的為對照組,每組設置5個復孔。處理結束后,每孔加20 μL MTT液(5 g/L),常規孵育4 h,棄掉上清,每孔加150 μL DMSO,震蕩數次使結晶能夠充分溶解。全自動酶標儀測定490 nm各孔的光密度值,計算細胞存活率。實驗重復3次。

1.3.3 qRT-PCR檢測UCA1基因表達

收集經0.25、0.5、1、2 mmol/L的MPP+處理24 h的SH-SY5Y細胞,TRIzol法提取細胞總RNA,按照試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為cDNA。根據UCA1和內參GAPDH基因序列及引物設計原則設計引物,由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列如下:UCA1 F 5’-TTTGCCAGCCTCAGCTTAAT-3’,R 5’-TTGTCCCCATTTTCCATCAT-3’;GAPDH F 5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCa-3’,R 5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’。

按照試劑盒說明書配制PCR反應體系和設置PCR程序,設置5個復孔,GAPDH作為內參基因。以所得Ct值,采用2-△△Ct公式計算UCA1基因相對表達水平。實驗重復3次。

1.3.4 實驗分組、處理及UCA1 siRNA轉染

實驗分為對照組(細胞不經特殊處理)、MPP+組(1 mmol/L的MPP+處理細胞24 h)、枸杞多糖組(400 μg/mL的枸杞多糖預處理細胞1 h后加1 mmol/L的MPP+繼續處理24 h)、si-UCA1組(1 mmol/L的MPP+處理細胞后轉染UCA1siRNA)、枸杞 多 糖+si-UCA1組。siRNA轉 染 參 照LipofectamineTM2000說明書。轉染前1 d接種生長至對數期的SH-SY5Y細胞于6孔板,接種密度為105個/孔,細胞生長達70%匯合度時,將UCA1 siRNA(si-UCA1)及陰性對照組(si-NC組)轉染SHSY5Y細胞,轉染48 h,采用qRT-PCR檢測UCA1基因表達。實驗重復3次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率

收集上述分組處理后的細胞,預冷PBS洗滌2次,加入300 μL結合緩沖液重懸細胞,避光環境分別加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI,室溫孵育15～20 min。上機前再加入300 μL的結合緩沖液,1 h內通過流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.3.6 流式細胞術檢測細胞ROS水平

收集按照上述分組處理后的細胞,棄掉細胞培養液。加入培養液懸浮細胞,離心,棄掉上清。加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA500 μL,避光孵育20 min。加入培養液重懸細胞,PBS洗滌細胞3遍,使用流式細胞儀檢測各組細胞熒光強度值。實驗重復3次。

1.3.7 流式細胞術檢測線粒體膜電位

收集按照上述分組處理后的細胞,加入500 μL培養基重懸細胞,然后加入500 μL的JC-1染色工作液,混勻,于37℃培養箱中常規孵育20 min,離心,棄掉上清。1×的JC-1染色工作液清洗細胞2次,離心,去掉上清。500 μL染色緩沖液重懸細胞,流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.3.8 Western blot檢測Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax蛋白表達

收集按照上述分組處理后的細胞,每孔加細胞裂解液200 μL,4℃搖床快速震蕩10 min,離心,取上清。BCA法測定總蛋白含量。總蛋白與5×loading buffer混勻,100℃水浴鍋10 min。在膠泳道中加30 μg變性蛋白,經電泳(恒壓100 V,3 h)、轉PVDF膜(200 mA,3 h)后,將轉好的膜浸泡在5%脫脂奶粉中,封閉1 h。加入一抗(1∶500),4℃孵育過夜,TBST洗膜。加入HRP標記的二抗(1∶1000),室溫孵育3 h,TBST洗膜。化學發光成像系統對膜進行成像分析,Image J軟件分析灰度值。以目的蛋白Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax灰度值與內參GAPDH灰度值比值為各蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.4 統計學方法

所有實驗數據采用SPSS 21.0軟件進行分析,計量資料用平均數±標準差(±s)表示,多組差異比較采用單因素方差分析,兩兩比較采SNK-q檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MPP+對SH-SY5Y細胞增殖及UCA1表達的影響

以對照組細胞存活率為100%及UCA1基因表達為1計算,隨著MPP+作用濃度增加,當細胞處理24 h后,細胞存活率呈現出下降趨勢,UCA1基因表達升高,其中0.5～2 mmol/L的MPP+與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。0.25 mmol/L MPP+處理后的細胞存活率及UCA1基因表達與對照組差異均無統計學意義(P＞0.05)。由于在MPP+作用濃度為1 mmol/L時,細胞存活率為(49.02±4.23)%,因此選擇1 mmol/L為MPP+的為最佳損傷濃度。見表1。

表1 MPP+對SH-SY5Y細胞增殖及UCA1表達的影響Table 1 Effect of MPP+on the proliferation of SH-SY5Y cells and the expression of UCA1

2.2 枸杞多糖對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞增殖的影響

MPP+損傷后的細胞存活率顯著低于對照組[(49.23±1.88)%比(100.00±2.12)%,P＜0.05];使用100、200、400 μg/mL枸杞多糖干預后,細胞存活率顯著升高[(56.97±2.15)%、(65.18±2.23)%、(77.25±3.11)%比(49.23±1.88)%,P＜0.05],而50 μg/mL枸杞多糖對MPP+誘導的細胞存活率無顯著影響[(49.88±1.74)%比(49.23±1.88)%,P＞0.05]。選擇400 μg/mL的枸 杞多糖進行后續研究。

2.3 枸杞多糖及si-UCA1單獨或聯合對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞增殖和凋亡的影響

SH-SY5Y細胞轉染UCA1 siRNA后,UCA1表達顯著低于對照組(0.255±0.026比1.000±0.026,P＜0.05),si-NC組UCA1表達與對照組差異無統計學意義(0.995±0.018比1.000±0.026,P＞0.05)。與對照組比較,MPP+組細胞存活率顯著降低,細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)。與MPP+組比較,LBP組和si-UCA1組細胞存活率顯著升高,細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05)。與LBP組或si-UCA1組比較,LBP+si-UCA1組細胞存活率顯著升高,細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05)。見圖1、表2。

表2 枸杞多糖及si-UCA1單獨或聯合對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞增殖和凋亡的影響Table 2 Effect of Lycium barbarum polysaccharide and si-UCA1 alone or in combination on proliferation and apoptosis of SH-SY5Y cells induced by MPP+

圖1 枸杞多糖及si-UCA1單獨或聯合對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞增殖和凋亡的影響Figure 1 Effect of Lycium barbarum polysaccharide and si-UCA1 alone or in combination on proliferation and apoptosis of SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.4 枸杞多糖及si-UCA1單獨或聯合對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞ROS水平的影響

DCF熒光強度可間接反映ROS水平。與對照組比較,MPP+組DCF熒光強度顯著升高(88.67±4.32比45.12±2.01,P＜0.05),說明MPP+可提高SH-SY5Y細胞中ROS水平。與MPP+組比較,LBP組和si-UCA1組DCF熒光強度顯著降低(63.56±2.81、68.74±3.13比88.67±4.32,P＜0.05),說明LBP或UCA1 siRNA可降低MPP+誘導的SHSY5Y細胞中ROS水平。與LBP組或si-UCA1組比較,LBP+si-UCA1組ROS水平顯著降低(52.34±2.71比63.56±2.81、68.74±3.13,P＜0.05),說明LBP及UCA1 siRNA聯合可增強二者單獨作用對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中ROS水平的抑制作用。

2.5 枸杞多糖及si-UCA1單獨或聯合對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞膜電位影響

紅/綠熒光比可直接的反映出線粒體膜電位的變化。與對照組比較,MPP+組紅/綠熒光比顯著降低(0.44±0.04比1.62±0.11,P＜0.05),說明MPP+可降低SH-SY5Y細胞膜電位。與MPP+組比較,LBP組和si-UCA1組紅/綠熒光比顯著升高(1.01±0.08、0.82±0.07比0.44±0.04,P＜0.05),說明LBP或UCA1 siRNA可提高MPP+誘導的SH-SY5Y細胞膜電位。與LBP組或si-UCA1組比較,LBP+si-UCA1組紅/綠熒光比顯著升高(1.41±0.09比1.01±0.08、0.82±0.07,P＜0.05),說明LBP及UCA1 siRNA聯合可增強二者單獨作用對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞膜電位的促進作用。

2.6 枸杞多糖及si-UCA1單獨或聯合對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax表達影響

與 對 照 組 比 較,MPP+組Cyt-C、caspase3、caspase9和Bax表達顯著升高,Bcl-2表達顯著降低(P＜0.05)。與MPP+組比較,LBP組和si-UCA1組Cyt-C、caspase3、caspase9和Bax表達顯著降低,Bcl-2表達顯著升高(P＜0.05)。與LBP組或si-UCA1組比較,LBP+si-UCA1組Cyt-C、caspase3、caspase9和Bax表達顯著降低,Bcl-2表達顯著升高(P＜0.05)。見圖2、表3。

表3 Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2和Bax的蛋白相對表達量Table 3 Relative protein expression of Cyt-C,caspase3,caspase9,Bcl-2 and Bax

圖2 枸杞多糖及si-UCA1單獨或聯合對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中Cyt-C、caspase3、caspase9、Bcl-2、Bax蛋白表達影響Figure 2 Effect of Lycium barbarum polysaccharide and si-UCA1 alone or in combination on the protein expression of Cyt-C,caspase3,caspase9,Bcl-2 and Bax in SH-SY5Y cells induced by MPP+

3 討論

MPP+是一種神經毒素,可通過抑制線粒體呼吸鏈復合物I,導致線粒體功能障礙、氧自由基大量產生及線粒體ATP缺失和膜電位降低,引起細胞損傷,最終導致神經元死亡,目前常用于建立帕金森病細胞模型[10-11]。SH-SY5Y細胞是一種分化程度很低的腫瘤細胞,與正常神經細胞有相似的細胞形態及生理生化功能,且生長繁殖較快,目前已廣泛用于帕金森病、阿爾茲海默癥等多種神經系統疾病模型[12-13]。本研究使用0.25～2 mmol/L的MPP+處理SH-SY5Y細胞,發現1 mmol/L的MPP+可抑制近一半的細胞增殖,因此選擇1 mmol/L的MPP+為最佳損傷濃度。50、100、200、400 μg/mL的枸杞多糖處理經1 mmol/L的MPP+損傷的SH-SY5Y細胞,細胞存活率呈劑量依賴升高,選擇400 μg/mL的枸杞多糖作為研究濃度。

越來越多的研究發現,帕金森病發病與線粒體損傷密切相關[14]。當線粒體呼吸鏈受到抑制時,可引起跨膜電位的改變、Cyt-C及凋亡相關的caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白釋放,最終引起細胞凋亡[15]。Cyt-C是一種信號物質,正常情況下存在于線粒體內外膜的腔中,當有凋亡信號刺激時,可從線粒體中釋放至胞漿,引起caspase9、caspase3活化,從而觸發凋亡級聯反應[16]。Bcl-2是一個抑凋亡蛋白,Bax為促凋亡蛋白,Bcl-2主要存在于線粒體外膜上,可通過直接或間接阻止Cyt-C從線粒體中釋放出來,從而抑制caspase9的活化[17-18]。當Cyt-C缺乏時,可引起ATP合成減少及ROS產生過度。ROS有高氧化活性,病理條件下,胞內大量的ROS堆積可引起DNA損傷,引起代謝系統及神經系統疾病的發生。本研究結果顯示,MPP+可抑制SHSY5Y細胞增殖,促進細胞凋亡,誘導ROS產生,降低細胞膜電位,上調促凋亡蛋白Cyt-C、caspase3、caspase9和Bax表達,下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達,這與Ramalingam等[12]研究吻合,表明帕金森病細胞模型構建成功。枸杞多糖處理可顯著逆轉MPP+誘導的上述改變,與Cao等[19]報道對H2O2誘導PC12細胞氧化損傷和凋亡的保護作用一致。UCA1已被證與多種細胞損傷相關,Tian等[20]研究顯示缺氧誘導的神經細胞中UCA1表達增加,UCA1 siRNA可提高細胞活力、抑制細胞凋亡,減輕缺氧損傷;Zhao等[21]證實UCA1 siRNA可增強脂多糖誘導的人胚肺WI-38細胞活力,緩解細胞凋亡和炎癥損傷。本研究發現,UCA1 siRNA可抑制MPP+誘導的SHSY5Y細胞ROS產生和凋亡,且枸杞多糖和UCA1 siRNA聯用的保護作用更明顯。以上研究表明,枸杞多糖及UCA1 siRNA通過線粒體凋亡途徑降低MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。然而,本文僅是細胞模型研究,這與整體動物特別是人體間可能存在一定差異,枸杞多糖及UCA1 siRNA的作用尚需進一步的觀察驗證。

綜上所述,枸杞多糖及抑制UCA1表達均可促進由MPP+誘導的SH-SY5Y細胞存活率,抑制細胞凋亡,兩者聯合對細胞存活率及凋亡率影響更明顯,機制可能與抑制線粒體凋亡途徑有關,提示枸杞多糖及UCA1基因聯合使用可能是帕金森病治療的新途徑。