和厚樸酚對D-半乳糖致腰椎間盤退變大鼠血清炎癥因子及細胞線粒體凋亡通路的影響

張 超吳俊學王 冶謝海洋彭 玲

(1.川北醫學院附屬醫院 骨外科,四川 南充 637000;2.川北醫學院附屬醫院 臨床營養科,四川 南充 637000)

椎間盤退變是一種與年齡相關的慢性過程,其特征是髓核細胞數量和功能減少,導致細胞外基質產生不足[1]。研究認為炎癥在細胞外基質代謝的發病機制中起著至關重要的作用[2]。促炎細胞因子抑制髓核細胞產生細胞外基質,誘導衰老,細胞死亡和變性椎間盤細胞自噬,導致椎間盤結構改變并引起臨床體征和癥狀[3]。目前對椎間盤退變的治療手段從保守治療到外科手術,然而,這些椎間盤退變的臨床治療方法存在很大的局限性,只能部分緩解椎間盤退變引起的癥狀,不能從根本上逆轉椎間盤退變。因此,應開發相應的有效藥物,真正改善椎間盤退變的進展。和厚樸酚是一種天然黃酮類化合物,從厚樸的根和樹皮中提取,研究表明,和厚樸酚在體內外具有抗氧化、脂質過氧化、抗炎癥的藥理作用及神經保護作用[4-7]。此外,最近一項使用大鼠尾巴模型的研究表明,和厚樸酚可以滲透并分布在椎間盤退變中,從而在體外和體內均達到治療效果[8]。這使得和厚樸酚成為治療椎間盤退變的一個有吸引力的候選物。本研究探索和厚樸酚對D-半乳糖致腰間盤退變大鼠血清炎癥因子含量變化,細胞外基質標記物表達水平及凋亡通路相關蛋白表達水平的影響,以期為今后椎間盤退變的臨床治療提供新的依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

45只SPF級健康成年雄性SD大鼠由川北醫學院實驗動物中心提供[SCXK(川)2018-018],鼠齡為6～7周,體重200～260 g。實驗期間飼養于該中心[SYXK(川)2018-076],溫度24℃～26℃,濕度50%～60%,光照12 h,自由飲食飲水,適應性喂養1周后進行實驗。該動物實驗得到了川北醫學院動物倫理委員會的批準(IACUC-2019-011),實驗過程中遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

和厚樸酚和D-半乳糖,美國Sigma公司;SRY相關HMG盒9(SOX-9)、II型膠原(Collagen II),蛋白聚糖(Aggrecan)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9、c-Myc兔來源一抗和HRP標記的山羊抗兔二 抗,英 國Abcam公 司;蛋 白Marker,美 國Fermentas公司;EDTA緩沖液(pH=8.0),武漢百耐特化工有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit,TaKaRa(DRR037S);SYBR?Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus),TaKaRa(DRR420A);PVDF膜,谷歌生物;RIPA強裂解液、ECL發光試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;大鼠IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α ELISA試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司。

高速低溫離心機,德國艾本德公司;Varioskan Flash多功能酶標儀和Nano Drop 2000,中國賽默飛世爾公司;OLYMPUS DP71顯微鏡,日本奧林巴斯光學有限公司;AMA440N高壓滅菌鍋,英國Astell公司;ABI StepOnePlusTM熒光定量PCR儀,美國基因儀器公司;電泳槽、電轉儀和BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統,美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組、模型建立與藥物干預

將SD大鼠隨機分為5組,每組9只,分別為對照組(Control)、D-半乳糖(D-galactose,D-gal)模型組(Model)、和厚樸酚低劑量組(2 mg/kg)、和厚樸酚中劑量組(4 mg/kg)、和厚樸酚高劑量組(8 mg/kg)。模型組和和厚樸酚低、中、高劑量組參照劉仁造模的方法[9],如表1所示,采用皮下注射D-半乳糖(300 mg/kg)方法建立衰老大鼠椎間盤退變模型。和厚樸酚低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給和厚樸酚2、4、8 mg/kg,對照組和模型組大鼠灌胃給予生理鹽水。連續給藥4周后處死大鼠,取腰部椎間盤進行相關研究。

表1 動物模型建立與藥物干預Table 1 Animal model establishment and drug intervention

1.3.2 HE染色

取部分大鼠腰部椎間盤放入4%多聚甲醛溶液固定24 h以上,然后將組織置于脫水機內依次梯度乙醇進行脫水后,石蠟包埋、切片;將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ、梯度乙醇進行脫蠟處理,然后蘇木精、伊紅染色;隨后依次用乙醇和二甲苯處理直至脫水透明,用中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.3.3 番紅O染色

石蠟組織切片制備同1.3.2,PBS清洗3次后,用1%番紅O染液浸染1.5 min;1%固綠染液復染1 min;體積分數75%乙醇分化2 s;自然晾干,二甲苯透明,中性樹脂封片后,光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 qRT-PCR檢測基因mRNA水平

使用TRIzol試劑提取大鼠椎間盤組織總RNA,并通過Nanodrop2000測定濃度,然后使用Super RT cDNA試 劑 盒 將RNA反 轉 錄 成cDNA。使 用Quantifast? SYBR? GreenPCR Kit在ABI 7500儀器上進行PCR,反應條件為95℃15 s;60℃60 s。SOX-9、Collagen II、Aggrecan和GAPDH的引物如下:SOX-9:5’-GGCCCTTCCTCTCCTCAACC-3’,5’-ACTGCCGTGGCCTTTTACA-3’;CollagenII:5’-GGG CTCCCAGAACATCACCTACCA-3’,5’-TCGGCCCTC ATCTCCACATCATTG-3’;Aggrecan:5’-ACATCCCA GAAAACTTCTTT-3’,5’-CGGCTTCGTCAGCAAAGC CA-3’;GAPDH:5’-AGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG-3’,5’-TGGTAACCAGGCGTCCGATACG-3’。

1.3.5 免疫印跡法

取適量大鼠腰椎間盤組織勻漿,用RIPA裂解緩沖液在4℃下提取蛋白質,使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠對等量蛋白質(40 μg)進行電泳,然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用含5%脫脂牛奶的TBST封閉膜1 h,一抗4℃孵育過夜,TBST洗滌3次,然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h,TBST洗滌3次,使用化學發光劑ECL顯示條帶,用Image J定量蛋白條帶灰度值。

1.3.6 ELISA法檢測血清炎癥因子含量

采用ELISA法測定大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量。操作步驟嚴格按照大鼠IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α試劑盒說明書進行。

1.3.7 TUNEL染色

石蠟組織切片制備同1.3.2,取石蠟切片用PBS清洗3次,每次5 min,然后與含有TdT和生物素化dUTP的TUNEL反應混合物37℃孵育1 h,用PBS洗3次,每次10 min,在37℃的洗滌緩沖液中孵育30 min終止反應。在光學顯微鏡下計數TUNEL陽性細胞的數量。

1.4 統計學方法

使用SPSS 21.0進行數據分析。所有數據用平均數±標準差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 和厚樸酚對椎間盤組織形態學變化的影響

HE染色結果顯示,對照組髓核排列規則;模型組大鼠椎間盤纖維環多不完整,出現破裂,髓核細胞減少;和厚樸酚低、中、高劑量組纖維環膠原纖維層較對照組薄,纖維環稍有裂隙,軟骨細胞浸潤比對照組增多,髓核細胞稍有減少;但與模型組相比退變方面表現出改善。與對照組相比,模型組和和厚樸酚低、中劑量組椎間盤組織形態學評分顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組椎間盤組織形態學評分顯著降低(P＜0.05)。模型組和和厚樸酚低劑量組較對照組番紅O淡染表明軟骨基質流失嚴重,軟骨組織受損,和厚樸酚中、高劑量組番紅O染色較對照組稍有減少,但與模型組比較軟骨組織損傷較輕(圖1)。

圖1 各組腰椎間盤組織形態學變化Note.A,HE staining.B,Safranin O staining.C,Histological score.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Figure 1 Histomorphological changes of lumbar intervertebral discs in each group

2.2 和厚樸酚對細胞外基質標記物表達水平的影響

與對照組相比,模型組SOX-9 mRNA、Collagen II mRNA、Aggrecan mRNA表達水平顯著降低(P＜0.05);和厚樸酚低、中、高劑量組SOX-9 mRNA和Aggrecan mRNA表達水平顯著降低(P＜0.05);和厚樸酚低、中劑量組Collagen II mRNA表達水平顯著降低(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組SOX-9 mRNA、Collagen II mRNA和Aggrecan mRNA表達水平均顯著升高(P＜0.05)(表2)。與對照組相比,模型組SOX-9、Collagen II和Aggrecan蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05);和厚樸酚低、中劑量組SOX-9、Collagen II和Aggrecan蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組SOX-9、Collagen II和Aggrecan蛋白表達水平均顯著升高(P＜0.05)(圖2)。

圖2 各組SOX-9、Collagen II和Aggrecan的蛋白表達水平變化Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Figure 2 Changes in the expression levels of SOX-9,Collagen II and Aggrecan proteins in each group

表2 各組SOX-9、Collagen II、Aggrecan的mRNA表達水平變化Table 2 Changes in mRNA expression levels of SOX-9,Collagen II and Aggrecan in each group

2.3 和厚樸酚對血清中各炎癥因子含量的影響

與對照組相比,模型組和和厚樸酚中、高劑量組IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量均顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著降低(P＜0.05);IL-10的含量顯著升高(P＜0.05)(表3)。

表3 各組IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的含量變化Table 3 Changes of IL-1β,IL-6,IL-10 and TNF-α levels in each group

2.4 和厚樸酚對椎間盤組織凋亡的影響

與對照組相比,模型組和和厚樸酚低、中劑量組凋亡細胞數顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,厚樸酚中、高劑量組凋亡細胞數顯著降低(P＜0.05)(圖3)。

圖3 各組腰椎間盤細胞凋亡變化(TUNEL染色)Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Figure 3 Apoptosis of lumbar disc cells in each group(TUNEL staining)

2.5 和厚樸酚對線粒體凋亡相關通路蛋白表達的影響

與對照組相比,模型組和和厚樸酚低、中劑量組Bcl-2/Bax蛋白水平顯著降低(P＜0.05);Caspase-9、Caspase-3、c-Myc的蛋白水平均顯著升高(P＜0.05)。與模型組相比,和厚樸酚中、高劑量組Bcl-2/Bax蛋白水平顯著升高(P＜0.05);Caspase-9、Caspase-3、c-Myc的蛋白水平均顯著降低(P＜0.05)(圖4)。

圖4 各組中Bcl-2/Bax、Caspase-9、Caspase-3和c-Myc蛋白的表達變化Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Figure 4 Protein expression changes of Bcl-2/Bax,Caspase-9,Caspase-3 and c-Myc in each group

3 討論

椎間盤退變是一種多因素疾病,可導致多種脊柱相關疾病,如慢性腰痛、椎間盤突出和椎管狹窄。隨著醫療技術的發展,目前最常見的是保守治療和外科手術治療,但是這些治療方法療效有限,無法從根本上治療和逆轉椎間盤的退變進程。因此研究椎間盤退變的分子生物學機制,為尋找新的治療椎間盤退變的方法具有非常重要的意義。

正常人椎間盤HE染色發現髓核結構完整,細胞和細胞外基質網絡結構良好。隨著椎間盤退變的加重,髓核組織內網狀結構逐漸消失,纖維逐漸增多、增粗,髓核組織分裂增多,體積縮小。Tang等[10]研究發現,在給予和厚樸酚后,裂隙數量減少,髓核組織大小恢復,和厚樸酚處理的大鼠椎間盤的組織學評分(表明椎間盤退變的程度)明顯降低。與前人研究一致,本研究發現和厚樸酚明顯降低椎間盤組織形態學評分,減少軟骨基質流失,表明和厚樸酚對椎間盤退變具有緩解的作用。

SOX-9、Collagen II、Aggrecan是細胞外基質標記物,與椎間盤退變有著密切的聯系。Collagen II和Aggrecan使髓核保持水分,從而緩沖和吸收壓力[11]。當細胞外基質的分解代謝活性超過其合成代謝活性時,Collagen II和Aggrecan的相對含量降低,導致水分流失和椎間盤退變的發生發展[12]。研究發現SOX-9的增加可以正向調控包括aggrecan和collagen在內的軟骨細胞特異性基因的表達[13]。此外,和厚樸酚能明顯增加SOX-9和Aggrecan的表達,緩解細胞外基質的變性[10]。與前人研究一致,本研究發現和厚樸酚明顯上調SOX-9、Collagen II、Aggrecan的表達,表明和厚樸酚能促進細胞外基質的生成,延緩椎間盤退變的發展。

炎癥在椎間盤退變的早期階段起著重要的作用,促炎介質由椎間盤退變過程中炎癥細胞(淋巴細胞和巨噬細胞)和椎間盤成分(纖維環和髓核)的雙重來源產生[3,14]。IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α與其他炎癥介質一起誘導衰老,細胞死亡和變性椎間盤細胞自噬,導致椎間盤結構改變并引起臨床體征和癥狀[3]。據報道,IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平在椎間盤退變中被上調,IL-10表達水平被下調,從而觸發降解酶的產生以及免疫細胞向椎間盤突出或退變的椎間盤中的浸潤[15-18]。研究發現和厚樸酚能夠抑制IL-1β和IL-6的表達,表明和厚樸酚可能在抑制椎間盤退變的發病機制方面有價值[10]。與前人研究一致,本研究發現和厚樸酚明顯降低IL-1β、IL-6和TNF-α含量,提高IL-10的含量,表明和厚樸酚能減輕炎癥,從而減緩椎間盤退變。

細胞凋亡是椎間盤細胞死亡的一種非常重要的類型,在椎間盤退變過程中起著至關重要的作用。研究發現川芎內酯能促進髓核細胞中Bcl-2的表達,并降低Bax和Cleaved-Caspase 3的表達[19]。miR-532可下調c-Myc和Survivin蛋白的表達[20]。而在關于和厚樸酚對椎間盤退變的研究,Tang等[10]研究發現和厚樸酚預處理可以抑制凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3和Bax的表達。與前人研究一致,本研究發現和厚樸酚明顯增加Bcl-2/Bax蛋白表達水平,降低Caspase-9、Caspase-3、c-Myc的蛋白表達水平,表明和厚樸酚能夠抑制椎間盤細胞的凋亡,有望防止或逆轉早期椎間盤退變的發生。

綜上所述,本研究通過和厚樸酚降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,提高IL-10的含量,促進SOX-9、Collagen II、Aggrecan的 表 達 以 及 抑 制Caspase-9、Caspase-3、c-Myc的蛋白水平,表明和厚樸酚對腰椎間盤退變具有緩解作用,為和厚樸酚用于椎間盤退變的防治提供了實驗依據。