基于SYRCLE風險評價工具及實驗研究報告規范評價電針干預脊髓損傷后神經源性膀胱動物實驗報告質量

王瑞奇黃春華吳清忠劉浪輝官磊瑤徐 添

(1.江西中醫藥大學研究生院,南昌 330006;2.江西中醫藥大學附屬醫院,南昌 330006)

脊髓損傷(spinal cordinjury,SCI)是一種有較高發病趨勢的嚴重的創傷性神經系統疾病,不僅嚴重影響患者的生活質量,而并具有高致殘、高致死的臨床特征[1]。神經源性膀胱(neurogenic bladder,NGB)是SCI所引起的最重要的并發癥之一,有超過80%的SCI后患者出現不同程度的膀胱功能障礙,主要表現為尿失禁和尿潴留[2],使得罹患此病的患者受盡百般折磨,也給患者及其家庭帶來了沉重的負擔。尿液的儲存和排尿是一個復雜的過程,需要脊髓整合來自大腦、膀胱和尿道的信息,當脊髓損傷時,使與控制排尿有關的中樞神經系統或周圍神經受到損害而出現膀胱或尿道的功能障礙,脊髓損傷發生在骶上段則表現為尿失禁,發生在骶段,表現為尿潴留。若膀胱不能有效排空,會帶來更加嚴重的后果,如尿路感染,尿路結石,慢性腎功能衰竭和尿毒癥等[3]。

目前對于NGB的治療多數研究側重于通過清潔間歇性導尿,藥物和外科手術等治療手段,但是,這些治療方法并不令人滿意。反復多次采用清潔的間歇性導管插入術來促進排尿,這可能導致反復的尿路感染并降低生活質量[4]。長期使用抗膽堿能藥物,可能會導致口干、便秘、視力模糊、嗜睡以及皮膚和粘膜干燥等副作用[5]。此外,對于NGB所采用的外科手術,如擴大膀胱成形術,可能會解決與膀胱容量有關的問題,但會導致尿路感染、尿路結石癥和其他并發癥[6]。當前已有大量的臨床研究及系統評價報道電針治療NGB取得了很好的療效[7-9],因其操作簡便、毒副作用少等優勢而在臨床廣泛應用。有研究表明,電針能夠加強對腹下神經、盆神經和陰部神經的刺激,被動地引起膀胱內括約肌、逼尿肌的節律性收縮,促進排尿反射的建立[10]。而且能夠促進神經修復、改善損傷區微環境、抑制神經細胞凋亡[11]。因此,有不少研究人員通過基礎實驗來探索電針治療SCI后NGB的內在機制。

動物實驗在基礎研究中扮演非常重要的角色,在進行臨床試驗之前,治療方法的安全性和有效性通常需要先在動物模型上進行測試,其結果對下一步設計和實施臨床研究具有重要的參考價值。但如果動物實驗方法學質量存在缺陷,就很有可能導致其研究結果不科學、不準確,報告不完整、不規范會使讀者無法真正了解研究的真實性和實用性[12-13]。隨著動物實驗的廣泛開展,動物實驗報告不規范或不充分的問題逐漸得到重視。SYRCLE動物實驗風險評估工具(SYRCLE’s risk of bias tool for animal studies)是2014年動物實驗系統評價研究中心的Hooijmans等多名學者基于Cochyane風險評估工具所制定的,以提高動物實驗的方法質量及研究過程的透明化。2010年先后發表了ARRIVE指南(animal research:reportingin vivoexperiments guidelines)[14]和GSPC清 單(gold standard publication checklist)[15],為撰寫和發表動物實驗報告提供了寫作指南和參考清單,確保動物實驗所提供的信息能夠被充分評估和利用[13]。然而國際實驗動物中心研究人員發現很多實驗人員對ARRIVE 2010中很多條目無法正確理解,甚至認為指南中諸多條目與自己實驗無關,可能導致動物實驗報告的不完整性[16-17]。因此Sert等[18]對ARRIVE 2010進行修訂,對所有條目的重要性的先后順序做出說明,2019年在線發布了ARRIVE 2019。因此,本研究旨在通過SYRCLE風險評價工具及實驗研究報告規范(ARRIVE 2019指南和GSPC清單)評價當前電針干預治療SCI后NGB動物實驗的報告質量,發現和總結目前在動物實驗報告方面存在的問題,并且希望以此引起研究人員對動物報告指南的重視,能夠進一步改進動物實驗的設計、實施與報告規范,提高動物研究的嚴謹性和可重復性。

1 材料和方法

1.1 納入標準

研究對象:脊髓損傷后神經源性膀胱的動物實驗,實驗動物包括鼠、兔、狗等;研究類型:動物實驗的隨機對照試驗,語言僅限中、英文;干預方式:試驗組單用電針治療,對照組治療措施不限。

1.2 排除標準

非脊髓損傷引起的神經源性膀胱,如糖尿病、中風后或盆腔術后等;實驗組非單純使用電針治療的動物實驗;非動物實驗,如理論研究、臨床研究、綜述、經驗個案等;重復發表的文獻(如:同一作者同一研究切實驗結果相同發表在國內不同雜志、在國內外同時發表或者發表在同一雜志被不同數據庫收錄)僅取1篇。

1.3 檢索策略

計算機檢索中國知網、萬方、維普、中國生物醫學文獻數據庫、PubMed、Web of science和Cochrane library等數據庫。中文檢索詞為“電針”、“針灸”、“針”、“神經源性膀胱”、“尿潴留”、“脊髓損傷”、“排尿 障 礙”、“鼠”、“兔”等。英 文 檢 索 詞 為“electroacupuncture”、“acupuncture”、“needle”、“neurogenic bladder”、“urinary retention”、“spinal cord injury”、“mouse”、“mice”、“rabbit”等。檢索日期為2010年1月1日至2020年10月28日。檢索詞采用主題詞和自由詞相結合,并手動檢索相關參考文獻。

1.4 文獻質量評價方法

采用SYRCLE動物實驗風險評估工具進行方法學質量評估,采用ARRIVE 2019指南的21個條目39個亞條目和GSPC清單的10個條目的54個亞條目對納入研究進行評價。由2位評價人員根據SYRCLE動物實驗風險評估量表、ARRIVE指南和GSPC清單的每一個條目分別對納入研究進行評價,其中SYRCLE動物實驗風險評估工具通過參考陶功財等[19]對本評估量表的解讀進行評價,若研究采用合理的方法降低偏倚風險則評價為“低風險”,若研究提供的信息不充分,無法評估其偏倚風險則評價為“不確定風險”,若研究采用了錯誤的方式增加了偏倚風險發生的可能性則評價為“高風險”[20]。同時對每個條目進行賦分,“低風險”2分,“不確定風險”1分,“高風險”0分,最后計算每項研究的總分。ARRIVE 2019指南和GSPC清單根據文獻對每個亞條目的符合情況作出“高風險”、“中等風險”、“低風險”的判斷,“低風險”是指待評價文獻詳細地報告了該亞條目所涉及的全部信息,“中等風險”指待評價文獻僅部分提及亞條目信息,“高風險”指待評價條目未涉及亞條目的具體信息。在進行前,2名評價人員需進行集中培訓,明確并統一各個條目的評價標準,當遇分歧時交由第3名評價人員(黃春華副主任中醫師)進行仲裁,具體統計結果見表1～表4。

1.5 統計學方法

所有評價條目結果均在Excel 2019中進行統計分析,計數資料采用例數和百分比(%),采用Stata 14.2軟件進行數據分析,結局指標為連續變量則采用SMD和95%可信區間(CI)表示。進行異質性檢驗,若無明顯異質性(I2＜50%,P＞0.10),選擇固定效應模型;反之則選擇隨機效應模型。

2 結果

2.1 文獻篩選結果

初步篩選出1423篇文獻,將其導入Note Express 3.2.0中剔除543篇重復文獻,剩余880篇,進一步閱讀題目、摘要及全文進行篩選,排除非動物實驗類研究345篇,非脊髓損傷損傷后NGB 291篇,其他療法或聯合治療211篇,重復發表研究6篇,無法獲取全文1篇,最終納入26篇[21-46],包括25篇中文文獻,1篇英文文獻,其中6篇學位論文,20篇期刊文獻。

2.2 SYRCLE風險評價工具評估結果

SYRCLE動物實驗偏倚風險評估工具是目前唯一專門針對動物實驗內在真實性評估的工具[47],是在Cochrane偏倚風險評估工具的基礎上建立的,共包括10個條目,其中基線特征、動物安置隨機化、隨機性結果評估為新增條目。如表1所示,在10個條目中:(1)分配序列:有18項(69.2%)研究使用“隨機數字表法”進行分組,評為“低風險”;剩余研究僅提及“隨機”而未進行詳細說明評為“不確定風險”。(2)基線特征:所有研究僅提及了大鼠的年齡、性別、體重、種類中的一個或多個,而實驗中相關結局指標的基線值等均未提供,故均評價“不確定風險”。(3)隱蔽分組:所有研究僅提及“隨機”或“隨機數字表”,提供的信息不夠充分,未能實現隨機序列的不可預測性,故評價為“不確定風險”。(4)動物安置隨機化:僅有14項(53.85%)的研究表明將大鼠放置在自由飲水,相同溫度、濕度等飼養情況相同的環境中單籠喂養,評為“低風險”。(5)、(7)盲法:所有研究均未描述對動物飼養者、研究者和結果評價者施盲,故均評為“不確定風險”。(6)隨機結果評估:所有研究均未采用如隨機數字表等正確的隨機方法選取實驗動物用于結果評價,均評為“不確定風險”。(8)不完整數據報告:有21項研究(80.77%)在實驗過程中有缺失數據(動物死亡或剔除),但均未對缺失數據是否影響最終結果真實性進行任何說明,故評為“高風險”。(9)選擇性結果報告:僅有1項研究將膀胱最大容量設定為需觀察的結局指標但未對結果進行報告,評價為“高風險”;其余研究均為出現不完整數據報告,評價為“低風險”。(10)其他偏倚來源:有1項研究用新的大鼠加入到實驗以彌補被剔除的死亡大鼠,故評為“高風險”。見表1。

表1 SYRCLE動物實驗風險評估工具評估結果Table 1 Evaluation results of SYRCLE animal experiment risk assessment tool

從各研究的總評分看,自2014年制定了SYRCLE動物實驗風險評估工具以來,從事電針干預治療SCI后NGB的研究人員并未對此量表引起重視,未采取恰當措施降低各類偏倚風險,各項目評分沒有明顯變化,尤其是在“盲法”和“隨機性結果評估”方面,僅有18項(69.23%)的研究使用了“隨機數字表法”進行分組,雖然從表中可以看出“分配序列”在2013～2019年一直保持在較高水平,然而2020年的6項研究中僅有2項采用“隨機數字表法”,因此應該加強和推廣SYRCLE動物實驗風險評估工具的使用。

2.3 ARRIVE 2019指南評估結果

ARRIVE 2019指南主要用于指導動物實驗研究和實驗設計,根據最新的ARRIVE 2019指南,將所有條目分為10項必備條目和11項補充條目,共含39個亞條目,詳見表2、表3。

表2 ARRIVE 2019指南10項必備條目評價結果Table 2 Evaluation results of 10 essential items of ARRIVE 2019 guide

表3 ARRIVE 2019指南11項推薦條目評價結果Table 3 Evaluation results of 11 recommended items in the ARRIVE 2019 guide

2.3.1 ARRIVE 2019指南10項必備條目

在10個必備條目的23個亞條目中,低風險率為43.14%,中度風險率為26.42%,高風險率為30.43%。其中在研究設計方面:26項研究均能提供簡要的研究設計細節。在樣本量方面:26項研究均提供了每組的動物數量及總數量,但均未解釋樣本量的確定方法。在納入和排除標準方面:26項研究均有描述造模后的排除標準(如死亡、自噬以及膀胱破裂等)但未具體描述如何使用實驗數據;有21項研究報道了剔除動物,大多是因死亡、其他并發癥或者造模失敗;26項研究均給出了各組的樣本量。在隨機化方面:有18項研究采用隨機數字表法,8項研究僅提及隨機而未指明方法;26項研究均未采取減少潛在偏倚的措施。盲法方面:僅有2組研究指出采用3人單盲對造模結果進行記錄并整理分析,但實驗過程及數據分析方面均未施盲。結果測量方面:26項研究均對評估結果的標準進行描述,如尿動力學、基因表達、蛋白表達等,但均未確定用于確定樣本量的主要結局指標。統計方法方面:26項研究均只簡單的描述了統計方法,所有研究均報告了統計分析中使用的實驗單位。實驗動物方面:僅有8項研究詳細描述了動物品種、年齡、性別和重量等,其余18項研究大多為對動物和年齡和重量有遺漏,26項研究均給出動物來源,而對健康/免疫狀況、基因修飾狀況等情況未做描述。實驗步驟方面:26項研究均記錄了操作方法和時間,但對實驗的基本原理均未做描述,僅有3項研究記錄了操作地點如實驗室等。結果方面:26項研究均對每項結局指標的結果進行描述,但均未測量每組實驗數據的變異度和置信區間。

2.3.2 ARRIVE 2019指南11項推薦條目

在11項推薦條目的16個亞條目中,低風險率為23.56%,中度風險率為16.83%,高風險率為59.61%。其中在摘要方面:有21項研究能夠按指南要求進行描述,有5項研究在實驗動物或關鍵方法方面描述不完全。在背景方面:26項研究均給予了科學的研究背景,然而僅有4項研究對動物模型的選擇進行了解釋,并且4項研究均為學位論文。在目的方面:僅有7項研究清楚的描述了實驗研究問題,研究的主要和次要目的,并提出被驗證的具體研究假設。在倫理聲明方面:僅有2項研究既提供了動物許可證號又表明通過倫理審查,18項研究僅提供了動物許可證號,6項研究倫理審查、許可證編號均未提供。飼養場所方面:僅有6項研究提供了飼養場所及陽光、溫度、濕度等飼養條件的詳細信息,9項研究僅簡單描述,11項研究未做描述。在動物護理和檢測方面:僅有3項研究指出在實驗過程中對動物處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》并實施具體緩解痛苦的措施,5項研究僅提及符合《關于善待實驗動物的指導性意見》而對采取的措施未做具體描述,18項研究均未提及。在詮釋/科學內涵方面:26項研究在解釋結果時均對研究目的、假設以及相關研究進行了論述并提供參考文獻,僅有6項研究描述了研究的局限性。概括/轉換方面:26項研究均未提及研究成果能轉化到其他物種或實驗條件。注冊計劃書方面:由于目前未對動物實驗進行全面的注冊,因此,26項研究均無法獲取研究計劃書。數據共享方面:26項研究均未說明研究數據是否可用以及在何處可用。利益聲明方面:僅有1項研究報告明確指出不存在利益沖突,其余均未描述。7項研究提供了資金來源,但未說明資助者所起到的作用,19項研究無資金來源。

2.4 GSPC清單

GSPC清單重點突出了報告飼養條件和設計動物實驗的基本原理,包括10個條目的54個亞條目,低風險率為20.45%,高風險率為24.09%,中度風險率為55.46%。(1)前言部分:有9項研究講述了當前SCI后NGB的研究進展并提供相關參考文獻,指出當前治療中存在的不足并確立明確的研究目標;26項研究均使用PICO原則;有4項研究提供了選擇模型的依據或模型的特異性,且均為學位論文,其余22項研究均未提及。(2)方法部分:26項研究均記錄了動物數量、性別、年齡等信息;所有研究均未進行微生物描述,但實驗報告中報告了動物的提供方;有12項研究對飼養場所的溫度、濕度等條件進行了描述,但未提及加減壓、燈光等因素,14項研究未提及飼養場所條件;21項研究提及單籠飼養但未描述原因;有15項研究說明食水自由,無時間限制;26項研究對造模成功的指征及干預措施進行描述;20項研究解釋了動物剔除原因;26項研究均未對對照組的重要性進行闡述;僅有2項研究描述了“3人單盲”其余均僅描述了具體結局指標及測量方法。(3)結果方面:26項研究對主要結果及納入動物或剔除動物等進行了描述,但是對剔除動物調整后所致的影響未做描述。(4)討論方面:26項研究均對主要結論及發現進行了討論并對研究結果可能帶給臨床和整個科學的意義進行闡述。見表4。

表4 GSPC清單評價25篇電針干預SCI后NGB動物實驗報告質量Table 4 GSPC checklist evaluates the quality of 25 NGB animal experiment reports after electroacupuncture intervention with SCI

2.5 實驗結果系統評價

對納入的26篇文獻的研究結果進行系統評價,對文獻中數據進行提取整理,數據相同的研究僅取1篇,由于尿動力學是評估排尿功能障礙患者的重要指標之一,因此結合納入研究綜合考慮以膀胱最大容量、漏尿點壓力、膀胱順應性作為主要觀察指標進行分析。其中膀胱最大容量和膀胱順應性異質性較大,采用隨機效應模型進行合并分析,而漏尿點壓力采用固定效應模型進行合并分析。使用“去除單項研究法”進行敏感性分析發現,剔除任意1項研究后,結果顯示每個獨立的研究結果對總體合并效應量無明顯影響。表明各研究間具有較高的同質性,所得結論較為可靠。系統評價結果顯示電針較模型組可以提高膀胱最大容量[SMD(95%CI)=3.22(2.78,3.66),P=0.00001]和膀胱順應性[SMD(95%CI)=2.69(2.24,3.14),P=0.00001],降低膀胱漏尿點壓力[SMD(95%CI)=-1.59(-1.98,-1.20),P=0.00001]。

續表4

3 討論

動物實驗是連接基礎研究和臨床試驗的橋梁,其設計和實施的質量能夠影響眾多領域課題研究的成果[20],通過SYRCLE動物實驗風險評估量表、ARRIVE指南和GSPC清單對2010年以來公開發表的電針治療SCI后NGB的實驗報告進行全面、系統的分析,我們發現在實驗報告方面仍存在諸多問題。(1)納入研究的實驗方法描述不完整,相對于臨床研究,“隨機化”應更容易在動物實驗中實施,但在分組時僅有18項研究說明使用“隨機數字表法”進行分組,在結果測量時僅有2項研究提及在檢測髓內細胞凋亡情況時“上下隨機各取3個切片”,在測量大鼠尿動力學等結果時均未提及隨機選取大鼠進行檢測。研究表明,大多數動物存在晝夜節律現象,脂質代謝、神經遞質水平、藥物動力學和其他因素會影響動物的晝夜節律,如果在進行結果評估時沒有隨機選取動物,則可能產生測量偏倚的風險[48]。(2)24(92.31%)項研究均未實施“盲法”,雖然在實驗過程中不需要對動物施盲,但是在干預實施和結果測量的過程中,若未施盲,可能導致預期實驗結果產生主觀偏倚。在以后的動物實驗中,建議研究者應注重采用“盲法”和“隨機化”原則的實施,或保持實驗組和對照組的結果評估方法不變,并應注意結果評估的隨機化,以減少測量偏倚。(3)在納入研究的研究目標中,所有研究均未分主要結局指標和次要結局指標,導致研究沒有側重點,也未給與確定樣本量的方法(算法或公式),樣本量不足可能導致假陰性的結果,遺漏一些潛在的重要發現,故非常有必要報告每組有多少動物參與實驗,以及實驗前用什么統計方法來確定樣本量。(4)所有研究均缺乏對動物基線特征的描述,由于動物實驗的樣本量一般小于臨床實驗,動物之間的個體差異較大,因此一些重要的基線特征的差異更易影響實驗結果的推斷。(5)動物的生存環境如溫度、濕度和光照等因素均會對實驗結果產生重要影響,因此動物實驗中對于動物的安置方式也極為重要,僅有53.85%的研究采用了“動物安置隨機化”,若未隨機安置動物,研究人員可能會對各組動物的行為表現產生一定的預見性,導致實施偏倚。并且在描述動物生存環境時應盡量詳細,如環境溫度、濕度、光照等做詳細描述,僅有12(46.15%)項研究對飼養場所做了部分描述。(6)有80.77%的研究報告有數據的缺失導致樣本量的減少但均未分析對剔除動物的處理和實驗結果的影響,容易導致實驗的不準確性和不可靠性,提示今后的研究者可以參考臨床研究中使用的意向性分析法(ITT)等來處理失訪數據[49]。由此可見,納入的電針治療SCI后NGB的動物實驗存在諸多報告信息不完整現象,由于未完整報告相關的重要信息如如何設計、實現和分析動物實驗,使讀者無法客觀、準確地評估該動物實驗可能產生的偏倚風險,并且使其他研究者重復實驗的可能性降低,會降低實驗的參考性,影響實驗的可靠性和真實性。通過對所納入研究的實驗結果進行系統評價發現,電針組較模型組能夠提高膀胱最大容量和膀胱順應性,降低膀胱漏尿點壓力,以此實現膀胱低壓儲尿、控制排尿的目的。

ARRIVE 2019指南是在ARRIVE 2010指南的基礎上進行調整,將原有的39個亞條目進一步劃分為23個必備條目和16個推薦條目,以便讓研究人員分清主次,在對必備條目充分報告的前提下對推薦條目進行描述,從分析結果來看,必備條目的中低風險率為69.56%,推薦條目的中低風險率為40.39%,說明研究人員對于必備條目的描述仍不充分。方澤萍等[12]、白哲等[13]通過調查動物實驗研究人員、雜志社“約稿”情況以及編輯對ARRIVE指南和GSPC清單的了解情況,發現目前國內期刊“稿約”對ARRIVE指南和/或GSPC清單的引入率為很低,并且在期刊編審人員和實驗研究人員中的知曉率較低,導致ARRIVE指南和GSPC清單在實際工作中應用較少,因此在評價時大多數條目均被評為為中高風險。

本研究也存在一定的局限性:(1)本研究分析評價了各大數據庫中電針治療SCI后NGB的實驗報告,但僅納入26篇文章,相對較少,其結果不能代表其他干預方法治療SCI后NGB及其他領域的實驗研究質量;(2)ARRIVE指南和GSPC清單的評估過程具有較強的主觀性,不同的評價者對于各條目風險的判斷不同,所得結果可能存在差異。

綜上所述,我們應采取針對性的措施進一步推廣和使用SYRCLE動物實驗偏倚風險評價工具、ARRIVE指南和GSPC清單,以有效指導動物實驗的設計、實施和報告,最終提升動物實驗報告質量并提高動物實驗研究的可重復性和實驗結果的再現性。