氯膦酸二鈉脂質體治療膝關節骨性關節炎的療效觀察

陸鋒藝 王雨 莊汝杰*

骨性關節炎（Ostereoarthritis，OA）是最常見的關節退行性疾病，臨床上以嚴重的疼痛及肢體功能活動障礙為主要特點［1］，嚴重影響患者的生活質量。然而，OA的發病機制尚不明確，既往臨床多責之于關節軟骨，關于關節軟骨的信號機制研究包括C5、hypoxia-inducible factor-2ɑ、syndecan-4、ADAMTS 等［2-5］。本研究通過建立小鼠膝關節骨性關節炎模型，并用氯膦酸二鈉脂質體（Clodronate liposomes，CL）進行干預，觀察膝關節破壞情況，以探討氯膦酸二鈉脂質體對膝骨關節炎的影響。巨噬細胞可吞噬注入人體內的氯膦酸二鈉脂質體，消化脂質體釋放氯膦酸二鈉，在巨噬細胞內聚集達到一定濃度后，巨噬細胞失去活性并凋亡［6］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與耗材 8 周齡雄性C57BL/6 小鼠，購自浙江中醫藥大學動物實驗中心。氯膦酸二鈉脂質體（LIPOSOMA，CP-005-005），帕瑞西布鈉（MCE，HY-17474A），Collagen 2 抗體（Abcom，Ab34712），MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（Beyotime，C0009S），RAW264.7 小鼠單核巨噬細胞系（Procell，CL-0190），96 孔板孔細胞培養板（NEST），DMEM 培養基（gibco），特級胎牛血清（HYCLONE，SH30070.03）。

1.2 實驗方法 SPF 級健康8 周齡雄性C57BL/6 小鼠30 只，隨機均分為A（CL）組，B（帕瑞西布鈉）組，C（空白對照）組，每組各10 只。A 組和B 組小鼠進行DMM 造模，建立小鼠KOA 模型，C 組不做處理。造模步驟參考WELCH 等［7］，術后4 周關節炎造模成功。在造模成功前1 周，A 組小鼠膝關節注射氯膦酸二鈉脂質體（1 mg/mL）6μL，1 次，進行巨噬細胞耗竭。從術后第4 周開始，B 組小鼠關節腔注射帕瑞昔布鈉（1 mg/mL）20μL，1 周2 次。C 組小鼠注射生理鹽水20μL，1 周2 次。

1.3 檢測指標 于造模后第4 周、第8 周獲取小鼠膝關節標本，并采用4%多聚甲醛固定。置于10%甲醛溶液中固定48 h 后，經0.27 mol/mL EDTA-2Na 脫鈣2 個月，每隔1 周更換脫鈣液。脫鈣后將膝關節石蠟包埋，從關節內側邊緣開始于矢狀平面連續切片，進行常規HE 染色及Ⅱ型膠原免疫組化，比較各組膝關節軟骨的病理變化。染色結果半定量分析以染色強度結合陽性細胞數百分比綜合計分。

1.4 細胞培養 RAW264.7 巨噬細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 完全培養基中，置于37 ℃、含5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養。將RAW264.7 巨噬細胞濃度調整為2×105個/mL，接種于96 孔板，100 μL/孔，置37 ℃、含5% CO2培養箱內貼壁培養3 h，分為空白對照組（0μg/mL）、空白脂質體組（150 μg/mL、175 μg/mL、200 μg/mL、225 μg/mL、250 μg/mL、275 μg/mL、300 μg/mL），CL 組（150 μg/mL、175 μg/mL、200 μg/mL、225 μg/mL、250 μg/mL、275 μg/mL、300 μg/mL），各組3 個復孔，分別培養24 h 后，加入10 μL 配置好的MTT 溶液，在細胞培養箱內繼續孵育4 h。每孔加入100μL Formazan 溶解液，適當混勻，在細胞培養箱內再繼續孵育。直至在普通光學顯微鏡下觀察發現Formazan 全部溶解，在570 nm 測定吸光度。

1.5 統計學方法 采用 SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用重復測量方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠膝關節HE 染色及二型膠原免疫組化 空白對照組為正常關節軟骨，CL 組的關節表面破壞較少，保留較多的健康完整的軟骨細胞。4周時帕瑞昔布組還有保留較多的軟骨細胞，8 周時軟骨細胞退變嚴重，關節表面破壞較CL 組嚴重。說明CL 可延緩軟骨細胞的退變。見圖1。

圖1 各組小鼠膝關節HE染色及二型膠原免疫組化（×40）

2.2 不同濃度CL 培養巨噬細胞的變化 巨噬細胞吞噬CL 后，氯膦酸二鈉在細胞內聚集，導致巨噬細胞凋亡，最終留下富含脂質體的巨噬細胞，稱為泡沫細胞，見圖2。MTT 試驗后，獲得不同組的OD 值，空白脂質體組各濃度之間無差異（P＞0.05）；CL 組各濃度之間，150 μg/mL、175 μg/mL、200 μg/mL、225 μg/mL、250 μg/mL 之間的OD 值存在差異（P＜0.05），而275 μg/mL、300 μg/mL 較高濃度下的OD 值無明顯差異（P＞0.05），巨噬細胞幾乎均轉化為充滿脂質的泡沫細胞。150 μg/mL、175 μg/mL 較低濃度下的OD 值反而高于空白對照組（0μg/mL），可見低濃度CL 對巨噬細胞的增殖有一定的促進作用。見表1 和圖3。

圖2 不同濃度CL培養的巨噬細胞

表1 不同CL濃度培養下MTT試驗后的OD值比較（±s）

表1 不同CL濃度培養下MTT試驗后的OD值比較（±s）

濃度（μg/mL）0150175200225250275300空白脂質體0.445±0.0490.435±0.0820.507±0.0950.436±0.0430.400±0.0480.412±0.0880.338±0.1230.330±0.125氯膦酸二鈉脂質體0.418±0.0690.605±0.1320.529±0.1150.424±0.0220.354±0.0750.264±0.0570.279±0.0440.275±0.068

圖3 不同CL濃度培養下MTT試驗后的OD值柱狀圖

3 討論

膝關節骨性關節炎（Knee Ostereoarthritis，KOA）是一種退行性骨關節疾病，是由衰老、肥胖和遺傳等多種原因引起的滑膜炎癥、關節軟骨的損傷、骨贅生成、韌帶松弛和關節周圍肌肉減弱。早預防、早診斷并給予有效的治療，不僅可以緩解疼痛癥狀、改善其生活質量，還可以降低晚期膝關節置換率，減輕家庭和社會的經濟負擔。研究發現，骨關節炎小鼠的滑膜組織中炎性巨噬細胞增加［8］，巨噬細胞產生的白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、基質金屬蛋白酶（MMPs）等炎性細胞因子，會加劇疼痛癥狀［9］，促進疾病發展［10］。比如，IL-6 等細胞因子為主的炎癥反應可以抑制軟骨中的聚糖蛋白和膠原合成，并上調MMP-13［11］；組織金屬蛋白酶抑制劑的下調也可導致MMPs 上調。因為軟骨細胞外基質中90%～95%的成分為Ⅱ型膠原蛋白，而MMPs 中的MMP-13 對裂解Ⅱ型膠原蛋白的活性最強［12］。

氯膦酸二鈉脂質體是一種人工合成的雙膦酸脂，是一種破骨細胞抑制劑，臨床多用于骨質疏松的治療［13］。巨噬細胞可吞噬注入人體內的CL，消化脂質體釋放氯膦酸二鈉，在巨噬細胞內聚集達到一定濃度后，巨噬細胞失去活性并凋亡，而體內的其它細胞如平滑肌細胞，由于不能吞噬體循環中游離的氯膦酸二鈉，而且氯膦酸二鈉的半衰期較短，對體內除吞噬細胞以外的其他細胞無明顯影響。VAN LENT 等［14］研究證實，在RA中CL 消耗巨噬細胞后，膝關節的炎癥表達明顯減少，但仍有相當多的蛋白多糖丟失，輕微的炎癥仍然可以對軟骨造成破壞。BLOM 等［15］在膠原酶誘導小鼠膝關節實驗性骨性關節炎中，于關節腔內注射CL 后，滑膜巨噬細胞耗盡導致骨贅形成顯著減少，說明滑膜巨噬細胞在實驗性OA 過程中是滑膜介導骨贅形成和其他OA 相關病理（如纖維化）的關鍵細胞，而CL 可以通過消耗滑膜巨噬細胞以減輕炎癥反應。TAKANO 等［16］研究發現，滑膜巨噬細胞是OA 小鼠降鈣素受體樣受體（CLR）的主要IL-1β 產生和調節細胞，可以用CL 小鼠的巨噬細胞耗竭降低滑膜中IL-1β 和CLR 基因的表達。李洪強等［17］研究發現，血管內皮生長因子（VEGF）在KOA 的發生、發展過程中發揮重要作用，可以影響軟骨細胞增殖、凋亡和代謝，刺激釋放基質金屬蛋白酶（MMP）及其他代謝介質來降解軟骨基質。IL-33 和ST2在人和鼠骨關節炎中升高［18］，IL-33 水平的升高加劇鼠骨關節炎的進展，進而增加軟骨降解蛋白酶（MMP-13、MMP-3 和ADAMTS-5）的表達，減少軟骨形成標志物（COL2A1、SOX-9 和Aggrecan）。而OA 關節中的IL-33主要來自軟骨細胞，所以在體內中和IL-33 和ST2 可以減少軟骨退化和疼痛。

關于CL 消耗巨噬細胞減輕炎癥反應的研究，既往實驗雖然證實了CL 在OA 中可見較少骨贅的生成，減少IL-1β 等炎癥基因表達，但CL 在OA 中的研究仍較少。本實驗結果驗證了CL 對軟骨的保護作用以及對巨噬細胞的耗竭作用。后續研究將繼續驗證CL 耗竭巨噬細胞后，膝關節中IL-6、MMP-13、TIMP-1、VEGF 以及IL-33 的表達。從目前證據來看，氯膦酸二鈉脂質體具有緩解OA 癥狀、保護軟骨的潛力，但具體通過調節哪些細胞因子來緩解OA，有待進一步研究探討。