廣泛期小細胞肺癌循環腫瘤細胞PD-L1表達與免疫治療療效及預后的相關性分析

邵哲成 范軍軍 王泳超

隨著肺癌驅動基因研究的深入，分子靶向治療取得飛躍發展。免疫治療是近幾年發展起來的另外一種治療手段，特別是對基于免疫檢查點抑制劑基礎上的PD-1/PD-L1 治療使部分驅動基因陰性患者的生存期顯著提高［1-3］。多種PD-1 和PD-L1 抗體已被FDA 批準用于EGFR/ALK 驅動基因陰性晚期非小細胞肺癌患者的標準治療。然而，并非所有肺癌患者均能從抗PD-1/PD-L1 抗體免疫治療中獲益，非小細胞肺癌及小細胞肺癌二線治療的有效率均低于20%，顯然不符合當前精準治療的標準，因此如何提高免疫治療的有效率是當前研究的熱點問題［4-5］。循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是脫離了腫瘤原發部位和轉移部位而進入血液循環中的各類腫瘤細胞的統稱。由于腫瘤本身具有的異質性，釋放到體液中的CTC 往往能夠代表腫瘤更強侵襲狀態以及更多惡性轉化的相關信息［6］。本文旨在探究小細胞肺癌患者活檢組織與CTC 中PD-L1 的表達差異以及與免疫療法的相關性，為臨床診療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016 年1 月至2018 年6 月于本院就診治療的廣泛期小細胞肺癌患者作為研究對象。（1）納入標準：年齡≥18 歲；組織學或細胞學確診為小細胞肺癌，根據美國退伍軍人肺癌協會（VALG）分期為廣泛期；存在不超過1 年的治療前腫瘤組織塊；具有經CT 或MRI 檢查可測量的病變。（2）排除標準：美國東部腫瘤協作組（ECOG）體力狀況評分＞2 分；存在免疫治療禁忌癥；人類免疫缺陷病毒或乙肝病毒感染者；患有≥2 級周圍神經病變；存在藥物過敏或不良反應者。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 組織學分析 在對CTCs 分析結果不知情的前提下，采用免疫組織化學染色（immunohistochemistry staining，IHC）評價肺癌組織內的PD-L1 表達，使用抗PD-L1 兔單克隆抗體（克隆E1L3N，細胞信號技術公司）。

1.3 CTCs分析 組織活檢與治療前的血液樣本采集時間間隔平均（7.5±1.2）個月，8 例（23.3%）患者的時間間隔短于1 個月，21 例（70.0%）為1～12 個月，2例（6.7%）超過1 年。采集血液樣本5 mL，2 h 內采用上皮腫瘤細胞大小分離法（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）獲取CTC。滿足以下標準其中4 項及以上的細胞認定為CTC［7］：①細胞核明顯增大；②核質比＞0.8；③色素增加和染色不均勻；④核膜不規則；⑤各向異性（比率＞0.5）；⑥存在核染色質側移或大核仁；⑦有絲分裂異常。無細胞質的細胞不予以分析。在對組織學分析結果不知情的前提下，使用兔mAb（克隆D8T4X，Cell Signaling Technology）和CD45（克隆MEM-28，Abcam）對每位患者的五個點（每個點1 mL血液樣本）進行PD-L1 免疫熒光染色。使用10%（v/v）AB 血清（Bio-Rad）進行非特異性結合阻斷，隨后將細胞與抗PD-L1-抗體（兔單克隆抗體，稀釋度1 ∶200）在室溫下孵育45 min，為了在血細胞背景中鑒定出加標的腫瘤細胞，將細胞與抗CD45 抗體（REA747 mAb，MACS Miltenyi Biotec，稀釋度1 ∶200）在室溫下放置45 min，使用DAPI（Carl Roth，稀釋度1 ∶1000）對細胞核染色。連接至AxioCam 相機（卡爾·蔡司），通過Axioplan 2 成像顯微鏡評估熒光結果，曝光1.6 s 后，評價CTC 的PD-L1 特異性免疫熒光，分為陰性（0）、弱陽性（+）、中度陽性（++）和強陽性（+++）。CTC 被定義為DAPI + / CD45-細胞且具有惡性細胞形態特征，例如大小、形狀、單核、細胞核與細胞質的比率等，見圖1。

圖1 CTC上PD-L1顯示

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計軟件。計數資料以［n（%）］表示，采用卡方檢驗和Fisher 精確檢驗；計量資料以中位數及范圍，使用Kruskal-Wallis 檢驗進行評估。采用Spearman 系數計算相關性；自免疫治療起始計算生存時間且通過Kaplan-Meier 方法進行評估；單變量分析計數變量采用時序檢驗，連續變量則采用Cox 比例風險模型。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者的臨床與病理特征 納入研究患者共30 例，確診時年齡35～78 歲，平均（60.6±1.5）歲；男19例（63.3%），女11 例（36.7%）；腺癌22 例（73.3%），鱗癌7 例（23.3%），肉瘤樣癌1 例（3.3%）；基因分型，EGFR 2 例（6.7%），KRAS13 例（43.3%），ALK 1例（3.3%），MET 1 例（3.3%），未進行基因檢測13 例（43.3%）；既往治療，化療28 例（92.7%），靶向治療5例（16.7），胸部放療4 例（13.3%）；免疫檢查點抑制劑治療采用納武單抗（Opdivo 奧德武，百時美施貴寶，50 mg/10 mL），每2 周歷時60 min 靜脈輸注給予3 mg/kg；治療進展中30 例，28 例既往接受化療但療效不佳。

2.2 CTCs 上PD-L1 表達及與組織學相關性 30 例患者均獲得可匹配的組織，組織中PD-L1 染色見于14 例患者，占比46.7%；27 例患者的組織獲得具體技術可知，70.4%的病例采用小活檢組織樣本的PD-L1 分析，其中63.0%經支氣管鏡檢查獲得，7.4%經CT 引導下活檢獲得，29.6%于手術切除標本時進行。

基線水平93.3%（28/30）樣本中檢測到CTCs，基線時每7.5 mL 樣本中CTCs 數量為3～228，平均32。CTCs表達PD-L1 的比例為0%～100%，平均為17.5%。87%的患者至少在1%的CTCs 上表達了PD-L1。見圖2。

圖2 基線水平活檢組織及CTCs上PD-L1的表達

治療前，活檢組織及CTCs 中PD-L1 表達之間無顯著相關性（r=0.05，P=0.82），兩者的吻合率為46.7%（14/30），剩余16 例不一致的病例中，13 例CTCs 中陽性而活檢組織中表達陰性，3 例則僅表現為組織上的陽性，14 例吻合的病例中4 例均為陰性，10 例均為陽性。

2.3 PD-L1 表達與免疫抑制劑治療反應的相關性 選擇基線水平的平均CTCs 作為截止值（32/7.5 mL），結果顯示與低CTCs 負荷相比，高CTCs 計數患者的臨床預后更差，無進展生存率（PFS）：HR 2.52［1.48～4.12］，P=0.0003；總生存率（OS）：HR 2.48［1.28～4.74］，P=0.0052），見圖3A 和3B。PD-L1 + CTCs 的存在與否對PFS 無明顯影響（閾值≥1%：HR 1.25［0.68～2.33］，P=0.59；閾值≥5%：HR 1.09［0.63～1.92］，P=0.92；閾值≥10%：HR 0.78［0.48～1.29］，P=0.28），或OS（ 閾值≥1%：HR 1.08［0.49～2.52］，P=0.92；閾值≥5%：HR 1.41［0.62～3.22］，P=0.47；閾值≥10%：HR 0.96［0.52～1.92］，P=0.90），見圖3C 和3D。免疫抑制劑反應者（PFS＞6 個月）基線水平的CTC 計數偏低（23.6VS.48.8，P=0.014），與CTCs PD-L1 陰性的患者比較，基線時PD-L1 + CTCs（≥1%）的患者更多表現為無反應［20/30（66.7%）VS.5/13（38.5%），P=0.02］，見圖4。活檢組織中PD-L1 的表達與臨床結局無關（≥1%：HR 0.66，P=0.25；≥5%：HR 0.84，P=0.52；≥50%：HR 0.79，對于PFS，P=0.63）。

圖3 CTC負荷及是否存在PD-L1+CTCs對患者OS和PFS的影響

圖4 基線時PD-L1 + CTCs數量與免疫抑制劑反應關系

2.4 進展中的PD-L1 + CTC 30 例患者中可獲得進展中的樣本，29 例存在CTCs。與治療前（32/7.5 mL）比較，進展中的CTCs 計數更高（53.6/7.5 mL，P=0.012）。所有患者存在PD-L1 + CTC（29/29），其中82.8%（24/29）的CTCs 上PD-L1 染色超過10%（治療前為67%），見圖2。

3 討論

本研究證實，晚期非小細胞肺癌患者通過CTCs 無創進行PD-L1 表達分析的可行性。PD-L1 在CTCs 上的表達可見于93.3%的病例中，在活檢組織中的表達為46.7%，可能與獲得的樣本量較少相關，因為在完成診斷步驟后剩余的組織樣本量通常很少，關于非小細胞肺癌的研究，采用了不同的裝置對此方法進行報道［8-11］。使用納武單抗治療期間，基于上皮標記物表達技術對CTCs進行監測顯示在基線水平時PD-L1 + CTCs的發生率為100%，另一組未經ICI治療的患者其循環免疫或腫瘤細胞中PD-L1 的表達與臨床預后不良相關［12］。然而，循環中PD-L1 染色的免疫細胞的具體影響仍不明確［13-16］，因為其不一定來自于腫瘤微環境。QIU 等［17］首次報道使用ISET 平臺與匹配組織的一致性，但PD-L1 是通過Ventana SP142 抗體的免疫組織化學染色進行操作的，染色的腫瘤細胞較少，相應的PD-L1 染色率較低，CTCs 上為8%（6/71），活檢組織上為15%（11/71）。因此，若要在臨床實踐中應用血液樣本對PD-L1 腫瘤表達進行檢測，需要對檢測步驟進行標準化，比如使用活檢組織的程序。除了兩種方法使用不同的抗體外，活檢組織與血液樣本的結果缺乏相關性，與部分文獻報道一致［18］，考慮原因有以下幾點：①采樣時間間隔差異，本研究使用的是檔案組織，活檢與采集血液樣本的時間間隔平均為7.5 個月，僅8 例患者在1 個月內完成兩項檢查；②腫瘤位置異質性，是組織學檢查的主要局限之一［19-20］。與手術切除的標本相比，組織活檢可能低估了PD-L1 陽性腫瘤的發現率，本研究顯示CTCs 中檢測陽性的患者比例較高，與其他研究使用手術切除標本進行觀察的結果相一致［21］。

生存率分析證實，CTC 負荷對接受ICI 治療患者臨床預后的預測價值，與文獻中的觀點相一致，即PD-L1的表達不利于患者的生存率［22］。還有研究認為，依賴于CTCs 的不利影響，無論PD-L1 的表達如何，腫瘤的轉移幾率和范圍仍較大。CTCs 的大量存在可能增加PD-L1 + CTC 發現的可能性，然而根據CTC 負荷的亞組分析顯示結果并未發生變化，那么臨床結局的差異可能與PD-L1 + CTC 的整體預后影響相關，而非僅取決于細胞對納武單抗治療反應的影響。MIGNON 等［23］報道了5/10 例患者在半年內PD-L1 + CTC 的持續存在與疾病進展有關。本組所有病情進展的患者均檢測到PDL1 + CTC，提示該細胞群存在獲得性ICI 抵抗。PD-L1+ CTC 的高發生率與相應活檢組織的不一致提示兩者之間存在互補。

綜上所述，對CTCs 進行PD-L1 分析是完全可行的，并且CTCs 的陽性率通常高于活檢組織中的陽性率。免疫抑制治療中基線時PD-L1 + CTCs（≥1%）的患者更多表現為無反應，治療前高CTCs 負荷與臨床預后不良有關，但CTCs 上PD-L1 的表達與否對預后無顯著影響。需要進一步的研究來評估液體活檢在免疫腫瘤學中的作用，包括其他循環標志物等。本研究尚存在一定的局限性，由于是單中心小樣本研究，在患者和研究方法的選擇上可能存在偏倚；另外，因為晚期肺癌患者發生間質轉化的CTCs 數量遠高于上皮型，所以有必要針對CTCs 的分型展開分析以強化研究結果；本研究納入的患者有92.7%既往接受過化療，因此屬于二線及以上的治療，患者的療效及臨床預后通常不佳，下一步需要深入探究CTCs中PD-L1表達對免疫檢查點抑制劑結合一線化療的指導價值，將有益于患者的生存預后。