香蕉枯萎病和健康植株根際土壤細菌群落結構差異對比分析

番華彩，魏 薇，曾 莉*，徐勝濤，李 舒，郭志祥，鄭泗軍

(1.云南省農業科學院農業環境資源研究所，云南 昆明 650205；2.昆明學院農學與生命科學學院/云南省都市特色農業工程技術研究中心，云南 昆明 650214)

【研究意義】香蕉枯萎病是一種毀滅性的土傳真菌病害，俗稱香蕉黃葉病或巴拿馬病，由尖孢鐮刀菌古巴?；?(Fusariumoxysporumf.sp.cubense) 侵染導致維管束壞死，造成香蕉的減產或絕收[1-3]。香蕉產業是云南的支柱性產業，是大邊疆、少數民族農民增收致富的重要途徑[4]。2009年，香蕉枯萎病在云南首次發現，目前在云南各香蕉主產區均有不同程度地發生，已嚴重威脅云南香蕉產業的可持續發展[5]?！厩叭搜芯窟M展】作物土傳病害的發生主要是由于土壤中微生物群落結構變化引起[6]，土壤中細菌的群落結構組成直接影響細菌的功能多樣性，并影響土傳病害的發生和發展[7-9]。關于香蕉枯萎病在土壤微生物類群方面的研究主要集中于不同香蕉品種、輪連作及拮抗菌施用對植株根際微生物類群的影響等方面[10-16]。云南香蕉在根際土壤細菌多樣性及群落結構方面的研究，特別是香蕉枯萎病和健康植株的根際土壤細菌群落差異對比尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】選取2種類型的香蕉植株根際土壤，研究香蕉枯萎病感病植株與健康植株根際土壤細菌群落結構多樣性及其差異，探索微生物群落結構與香蕉枯萎病之間的關系。【擬解決的關鍵問題】研究明確香蕉枯萎病與健康植株根際土壤細菌群落結構組成豐度及差異，探索香蕉枯萎病發生的微生態機制，優化根際土壤微生物微群落結構，為其香蕉枯萎病的后續生態防控提供新策略。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

云南省玉溪市元江縣屬于干熱河谷紅河流域，氣候類型為低緯度高原亞熱帶季風氣候，最高海拔2580 m，最低海拔327 m，年平均氣溫23.8 ℃，終年無霜。選擇元江縣香蕉種植基地(北緯23°35'19″N，101°59′29″E，海拔為380 m)進行樣品采集，基地土壤為磚紅壤沙質土，種植香蕉品種為桂蕉，生育期為抽蕾期；在香蕉枯萎發病率約為5%～8%的地塊，分別采集香蕉枯萎病(FB)和健康(CK)2種類型香蕉植株根際土壤。

2018 年 11月使用5點取樣法隨機采集香蕉枯萎病(FB)和健康(CK)植株根際土壤樣品，每個處理5次重復，用土壤采集器采集0～10 cm 土壤，收集附著在根系上的土壤作為根際土壤，混勻后用聚乙烯無菌袋密封(自封袋)置于冰盒中立即帶回實驗室，撿出根須、石子等雜質，得到5份香蕉枯萎病植株根際土壤樣品(FB:YJA，YJC，YJEA，YJEB，YJEC)，5份健康植株根際土壤樣品(CK:YJH，YJI，YJLA，YJLB，YJLC)，共計10份土壤樣品，置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.2 土壤微生物基因組DNA提取及檢測

參照FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒(MP Biomedicals，美國)的使用方法，對土壤樣品提取總DNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000 (Thermo Scientific，美國) 檢測土壤樣品總DNA濃度與純度后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 PCR擴增及高通量測序

利用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌的16 S rRNA進行V3～V4區的PCR擴增。擴增產物送至上海美吉生物科技有限公司在Illumina Miseq平臺上進行高通量測序。

1.4 數據處理和分析

運用QIIME(Uparse)8.0軟件對Illumina Miseq測序所得原始數據進行擴增序列處理，在97%相似性水平上進行OTUs[17]分類(Operational taxonomic units) 劃分，根據樣本間Unifrac距離矩陣進行主坐標分析 (PCoA)[18]，采用R的pheatmap package[19]繪制熱圖。使用多變量方差分析(PERMANOVA)通過 R(v.3.2.5)中的程序包(v.2.3-5)測試樣本間的差異。通過t-test 檢驗樣本間的顯著性，并使用單因素方差分析(ANOVA)獲得多組的顯著性。使用Mothur軟件，對門和屬水平上的細菌群落組成結構差異進行Lefse分析(P< 0.05)。運用R軟件分析各樣本 (組) OTU 數量，并通過 Venn 圖呈現各樣本 (組) OTU比例。

2 結果與分析

2.1 高通量測序數據分析

通過對香蕉枯萎病(FB)和健康(CK)植株根際土壤的10個樣品進行16 S rRNA 基因的 V3～V4 區擴增測序，共得到420 084條有效序列。香蕉枯萎病和健康植株根際土壤中包含的 OTU 數目分別是3432和2988個。根據各樣本 (組) 的 OUT數目，通過Venn 圖呈現香蕉枯萎病和健康植株樣品的 OTU數目組成比例(圖 1)，香蕉枯萎病和健康植株共有2854個OTU，發病組特有的有578個，對照組特有的有134個，其余為樣品間兩兩共有。通過隨機抽樣的序列數與其對應的 OTU 數目構建香蕉枯萎病和健康植株根際土壤的細菌稀釋曲線(圖2)， 10個香蕉植株根際土壤樣品的稀釋曲線平緩， 2種類型香蕉植株根際土壤樣品取樣合理，根際土壤樣品的細菌群落能夠得到體現。

2.2 土壤細菌群落α多樣性分析

通過細菌群落α多樣性分析，比較香蕉枯萎病和健康植株的土壤細菌多樣性差異。香蕉枯萎病植株的Ace指數和Chao1指數較健康植株的高，香蕉枯萎病植株細菌多樣性較豐富，香蕉枯萎病植株和健康植株的細菌α多樣性差異顯著(P<0.05)；在均勻度上，香蕉枯萎病植株根際土壤細菌的Shannon 指數高于健康植株，而Simpson 指數低于健康植株，差異顯著。

2.3 香蕉植株根際土壤細菌群落結構組成

通過使用QIIME 軟件對10個香蕉植株根際土壤樣品進行分析，門水平上，共有 34 個細菌類群，其中11個最大豐度的物種豐度柱形圖(圖3)表明，變形菌門 (Proteobacteria)為優勢菌群，占細菌總數的 31.0%～46.5%，其它優勢菌群依次為厚壁菌門(Firmicutes, 12.8%～22.6%)，放線菌門 (Actinobacteria, 9.9%～19.8%)，酸桿菌門 (Acidobacteria, 3.6%～12.2%)，綠彎菌門 (Chloroflexi, 4.1%～10.3%)，芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes, 3.5%～5.9%)，髕骨細菌 (Patescibacteria, 1.4%～2.1%)，擬桿菌門(Bacteroidetes, 1.1%～2.0%)，棒狀桿菌 (Rokubacteria, 0.1%～2.4%)。優勢門菌群中，厚壁菌門豐度健康植株較發病植株高，棒狀桿菌豐度發病植株較健康植株高。屬水平上，共有 513個細菌類群，豐度排名前 18的物種相對豐度柱形圖見圖4，香蕉枯萎病與健康植株的細菌群落組成有一定同源性，但細菌群落結構及豐度組成差異明顯。芽胞桿菌屬 (Bacillus, 9.5%)、芽單胞菌屬 (Gemmatimonadaceae, 4.0%)、鞘脂單胞菌屬 (Sphingomonas, 3.6%)和朱氏桿菌屬 (Chujaibacter, 2.7%)為香蕉枯萎病植株根際土壤中的優勢屬。健康植株根際土壤中的優勢屬為芽胞桿菌屬 (Bacillus, 16.6%)、朱氏桿菌 (Chujaibacter, 8.1%)、芽單胞菌屬 (Gemmatimonadaceae, 3.0%)和鞘脂單胞菌屬 (Sphingomonas, 2.2%)。優勢屬菌群中，芽胞桿菌屬、朱氏桿菌屬的豐度健康植株明顯高于枯萎病植株，而芽單胞菌屬和鞘脂單胞菌屬的豐度比率低于枯萎病植株。

2.4 細菌菌群群落組成聚類分析

在屬水平上，使用 R 軟件，對于10個樣品中豐度前50的細菌菌群繪制了Heatmap 熱圖聚類分析，分析了香蕉枯萎病和健康植株的根際土壤細菌群落的聚類熱圖(圖5)。10個樣品的細菌群落組成聚類為2個大的分支，香蕉枯萎病植株5個樣品和健康植株的5個樣品基本各為1個分支，香蕉枯萎病和健康植株的細菌群落組成結構有明顯差異。芽胞桿菌屬(Bacillus)在香蕉植株根際土壤中均為優勢菌群，豐度大小健康香蕉植株(CK)>香蕉枯萎病植株 (FB)；朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)在健康香蕉植株根際土壤中為優勢菌群，芽單胞菌屬(Gemmatimonadaceae) 在發病香蕉植株根際土壤中為優勢菌群。為了觀察微生物群落結構變化，進行了PCA分析(圖6)，從主坐標分析 (PCA) 圖可看出，香蕉植株根際土壤細菌群落結構組成有明顯變化，香蕉枯萎病和健康植株的細菌群落組成分離明顯，健康香蕉植株的細菌群落在右邊的軸上與香蕉枯萎病植株細菌群落能明顯區分開，差別突顯，同組的土壤樣品具有相似的細菌群落結構。

2.5 細菌群落組成結構差異分析

為進一步分析香蕉枯萎病和健康植株的細菌群落組成結構差異，使用Mothur軟件，對門和屬水平上最大豐度前20的細菌菌群進行了Lefse分析(P<0.05)。從圖7可以看出，門水平上(圖7-A)，在香蕉根際土壤中最大豐度前20的細菌菌群中，香蕉枯萎病和健康植株的細菌群落組成結構有5個門差異顯著，根據豐度大小依次為厚壁菌門 (Firmicutes)，棒狀桿菌門 (Rokubacteria)，硝化螺旋菌門 (Nitrospirae)，Latescibacteria和Dadabacteria。厚壁菌門在健康植株中的豐度比例較高，但棒狀桿菌、硝化螺旋菌門豐度比率低于枯萎病植株；屬水平上(圖7-B)，芽胞桿菌屬 (Bacillus)，朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)，土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)，伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)和Rokubacteriales等5個屬的組成結構在香蕉枯萎病和健康植株中差異顯著。芽胞桿菌屬 (Bacillus)、朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)、土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)和伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)在健康植株中的豐度比例高于香蕉枯萎病植株。

3 討 論

生態系統中的微生物多樣性豐富，在大自然的生物多樣性中具有重要的生態功能[20]，土傳病害的發生與植株根際土壤微生物數量及群落結構有密切關系[6]，土傳病原菌作為土壤微生物的一種，其種群必然受到土壤微生物多樣性的影響。研究結果表明,香蕉枯萎病和健康植株根際土壤細菌多樣性及群落結構和組成差異顯著，土壤細菌多樣性香蕉枯萎病植株高于健康植株，陳波等研究也有相同結果[21]，但與歐陽嫻[13]、林威鵬[14]等報道不一致，這可能與香蕉種植區域有關。變形菌門 (Proteobacteria)、厚壁菌門 (Firmicutes)、放線菌門 (Actinobacteria)和酸桿菌門 (Acidobacteria)等為香蕉植株根際土壤中的主要優勢門菌群，黃珍[12]、周登博[15]、沈宗專[16]、Janssen[22]也有相同的研究結果。研究認為，屬水平上，香蕉枯萎病和健康植株的根際土壤中有5個菌群差異顯著，依次為芽胞桿菌屬 (Bacillus)，朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)，土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)，伴伯克氏菌屬(Paraburkholderia)和Rokubacteriales；其中，芽胞桿菌屬 (Bacillus)、朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)、土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)和伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)健康植株的豐度比例高于香蕉枯萎病植株，芽胞桿菌屬 (Bacillus)和朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)在香蕉植株根際土壤中屬于優勢菌群。芽胞桿菌屬是厚壁菌門的一大類細菌，在不利于生存的環境條件下具較強抗逆性[23]，屬于有益細菌。研究結果表明，優勢菌屬芽胞桿菌屬 (Bacillus)在健康植株的根際土壤中豐度比例高于香蕉枯萎病植株，且差異顯著。這可能是芽胞桿菌屬對致病菌具有抵抗抑制作用，劉波[23]和杜貞娜[24]等研究也有相同結果。土壤鏈霉菌屬于放線菌門，是放線菌的次生代謝產物，對尖孢鐮刀菌等具有抑菌拮抗活性作用[25-26]，本研究土壤鏈霉菌在健康植株中的豐度比例高于枯萎病植株，在土壤中大量存在的土壤鏈霉菌可能抑制了枯萎病菌。研究結果還顯示，伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)在健康植株中的豐度比例高于香蕉枯萎病植株。可能是由于伴伯克氏菌屬能夠促進健康植株對磷素的吸收與利用[27-29]，繼而提高作物的抗逆性。

4 結 論

香蕉枯萎病和健康植株根際土壤細菌群落結構在一定程度上具有同源性，但部分菌群在2種類型植株根際土壤中的組成豐度有顯著差異。門水平上，厚壁菌門 (Firmicutes)，棒狀桿菌門 (Rokubacteria)，硝化螺旋菌門 (Nitrospirae)，Latescibacteria和Dadabacteria等5個菌群差異顯著；屬水平上，芽胞桿菌屬 (Bacillus)，朱氏桿菌屬 (Chujaibacter)，土壤鏈霉菌屬 (Streptomyces)，伴伯克氏菌屬 (Paraburkholderia)和Rokubacteriales等5個屬差異顯著。