耐旱與旱情敏感甘蔗品種根際土壤細菌群落組成及功能比較

陳思宇，孫 妍，覃仁柳，楊尚東*，譚宏偉

(1.廣西大學農學院，廣西 南寧 530004；2.廣西農業科學院/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是世界上最主要的糖料作物[1]和極具開發潛力的能源作物，已在我國廣西、廣東、云南和福建等南方地區廣泛栽培[2]。甘蔗植株高大，生長周期長，對水分需求量大，但我國甘蔗栽培區頻繁的干旱災害，已成為制約甘蔗生產發展的重要因子[3-4]。選育耐旱甘蔗品種是甘蔗育種研究的一項重要內容[5]，耐旱甘蔗育種研究中多依賴品種的田間表現及在脅迫條件下以植株生理生化指標的變化判斷其耐旱能力，缺乏評價甘蔗植株耐旱能力的穩定生物學指標。長期以來，植株的田間表現及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等保護性酶活性和丙二醛含量等生物學指標常被用于指示植物的抗逆性強弱[6]，但以田間表現和生理生化指標進行耐旱性判定不僅耗時較長，而且由于具有較大的隨機性和偶然性，費時而不敏感。已有研究表明，根際土壤細菌群落組成及其功能在生態系統修復[7-8]，植物連作土壤[9]及鹽堿地土壤[10]的開發利用中都具有一定指示作用，但至今缺乏針對田間條件下不同適應性甘蔗品種根際土壤微生物群落結構的比較研究。因此，分析耐旱性不同甘蔗品種根際土壤細菌群落結構及功能，對篩選和開發利用有益功能細菌及構建新型甘蔗耐旱評價體系和保障我國甘蔗產業可持續發展具有積極意義。【前人研究進展】現有研究表明，根際土壤細菌對不同耐旱性的駱駝蓬[11]和小麥[12]具有一定影響，根際土壤微生物對甘蔗影響的研究則多集中在不同栽培模式及抗病影響等方面[13-14]。已有研究表明，不同基因型或不同抗性作物品種的根際微環境會富集不同的微生物群落[15]，土壤微生物對土壤理化性狀變化非常敏感[16]，且已廣泛作為指示土壤肥力狀況及質量評價的生物學指標[17]。然而，至今育種研究中針對耐旱基因型的篩選多集中在植株自身的生物學性狀方面，例如：干旱會顯著降低甘蔗的根長、根干重和根表面積等根系性狀，但對根冠比無顯著影響[18]，這些根系指標對評價甘蔗的耐旱性具有參考意義。但是針對土壤生物學性狀[19]尤其根際土壤微生物與植株抗性相關性狀方面的研究還鮮見報道[20-23]。Xie等[24]、劉方[25]、潘根生等[26]、李躍等[27]研究結果顯示，植物具有通過改變其乙烯、脫落酸和乙酰水楊酸等內源激素含量水平提高其耐旱性的能力。其中，脫落酸對植株的耐旱能力發揮著關鍵作用，不僅可改變植物干旱脅迫下細胞的轉錄水平，還可影響植物脂類代謝和碳代謝等基礎代謝過程，具有啟動植物耐旱響應的功能[28]。脫落酸在干旱條件下對維持根系生長、滲透物質積累及活性氧代謝都有較強作用。此外諸多研究表明，細菌與生長素[29]、細胞分裂素[30]、脫落酸[31]、赤霉素[32]及乙烯[33]等植物內源激素的產生緊密相關。【本研究切入點】目前，通過不同耐旱性甘蔗品種根際土壤微生物群落結構組成比較以篩選和開發利用有益功能細菌的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】比較田間自然條件下2個不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌群落組成及其代謝功能，揭示不同耐旱性甘蔗品種的田間適應性差異機制，挖掘有助于提高甘蔗耐旱能力的功能細菌優勢門屬，為篩選和開發利用有益功能細菌及構建評估甘蔗耐旱能力的新型技術體系提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2019年3—10月在廣西大學農學院試驗基地(東經108°17′，北緯22°51′)設施大棚內進行。采用桶栽方式種植甘蔗。桶的規格為上徑49.3 cm、下徑34.5 cm、高度35.0 cm。每桶裝土約40 kg，種植3個單芽甘蔗莖段，桶底部鉆5個直徑為4.0 cm的圓孔。桶裝土壤按大田表土∶市售有機肥=5∶1混勻，土壤理化性質：pH 5.5，有機質21.6 g/kg，全氮1.15 g/kg，全磷0.72 g/kg，全鉀8.30 g/kg、堿解氮98.00 mg/kg，速效磷10.80 mg/kg，速效鉀156.00 mg/kg。

1.2 試驗材料

選取桂輻98-296(代號G1)和桂糖36號(代號G2)分別作為不同耐旱性甘蔗品種種植于桶裝土壤中，以不種植甘蔗的桶裝土壤為空白對照(CK)，共3個處理，每處理15桶。其中，桂輻98-296是具有良好耐旱、耐寒和耐澇等抗逆境能力且耐旱能力優于新臺糖22號的甘蔗品種(系)[34]，而桂糖36號適應中等水肥條件，耐旱能力遜色于新臺糖22號，屬于對水分敏感、旱情敏感的甘蔗品種(系)[35]。上述甘蔗品種均在相同水肥條件下以常規方式進行栽培管理。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤樣品采集 甘蔗進入伸長期后，分別隨機采集3個處理的根際土壤樣品。其中，2個甘蔗品種隨機選取長勢基本一致的3桶甘蔗植株，砍去上部蔗莖，留高30.0 cm蔗兜后，翻轉栽植桶倒出整個蔗兜，采用抖根法[36]收集根際土壤樣品；采用隨機取樣法采集CK的土壤樣品。

1.3.2 Alpha多樣性分析和物種Venn圖分析 使用UPARSE軟件對序列OTU進行97%相似度聚類分析并除去單序列和嵌合體，生成OTU表格；計算Alpha多樣性指數，以Shannon和Simpson指數指示細菌的多樣性，以Chao 1和Ace指數指示細菌的豐富度，并構建物種群落柱形圖和土壤物種組成Venn圖。以上數據均利用上海美吉生物醫藥科技有限公司提供的數據分析平臺I-Sanger進行分析。

1.3.3 根系樣品總DNA提取、PCR擴增和序列測定 測序具體類型與引物序列見表1。DNA抽提：土壤微生物總DNA采用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，美國)抽提，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的質量，并利用NanoDrop2000分光光度計(Thermo fisher scientific，美國)檢測DNA濃度和純度；在ABI GeneAmp?9700上，以提取的植物微生物DNA為模板，選擇338F和806R引物對V3～V4可變區進行PCR擴增。將同一樣本的PCR產物混合后使用2.0%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen biosciences，Union City，CA，美國)進行回收產物純化，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer(Promega，美國)對回收產物進行檢測定量。Illumina MiSeq測序：對PCR產物進行定量均一化混勻，使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：利用聚合DNA產物構建MiSeq文庫，利用MiSeq PE250平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

1.3.4 PICRUSt基因功能預測 首先通過PICRUSt去除16S Marker gene在物種基因組中拷貝數的影響，標準化OTU豐度表；利用每個OTU對應的green gene id，獲得OTU對應的KEGG Orthology(KO)信息和COG家族信息；并計算各COG豐度和KO豐度。通過COG數據庫對eggNOG數據庫進行解析，得到各COG的描述信息，以及其功能信息，并得到功能豐度譜；利用KEGG數據庫的信息，得出KO、Pathway和EC的數據，通過OTU豐度計算各功能類別的豐度。

1.4 統計分析

試驗數據采用Excel 2019和SPSS 21.0進行統計分析，并利用上海美吉生物醫藥科技有限公司的I-sanger云數據分析平臺進行在線數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌物種分類統計結果

由表2可知，桂輻98-296的根際土壤細菌隸屬于28門65綱151目282科495屬897種2121 OTUs；桂糖36號的根際土壤細菌隸屬于27門64綱149目279科493屬892種2109 OTUs；CK的根際土壤細菌隸屬于27門64綱147目279科491屬878種2100 OTUs。可見，桂輻98-296的根際土壤細菌數量在門、綱、目、科、屬和種分類水平上均高于相應的桂糖36號和CK，而桂糖36號根際土壤中，細菌分類數量僅在目、屬和種分類水平上高于CK。表明不同分類水平下，耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤中擁有比旱情敏感甘蔗品種桂糖36號根際土壤更豐富的根際土壤細菌種類與數量。

2.2 不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌的Alpha多樣性

由表3可知，2個不同耐旱性甘蔗品種和CK間根際土壤細菌的Shannon、Simpson、ACE和Chao 1指數均無顯著差異(P>0.05)。由此推測，在自然條件下，2個不同耐旱性甘蔗品種的根際土壤細菌可能未產生應激反應，從而使其細菌的多樣性和豐富度未表現出顯著差異特征。

表1 測序類型及引物序列名稱

表2 不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌物種分類結果

表3 不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌的Alpha多樣性比較

2.3 不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌群落結構分析

2.3.1 優勢細菌群落在門分類水平的分析結果 從圖1可看出，在門分類水平，CK土壤的優勢細菌門分類組成豐度占比排序為變形菌門(Proteobacteria，28.22%)>放線菌門(Actinobacteria，21.80%)>酸桿菌門(Acidobacteria，16.37%)>綠彎菌門(Chloroflexi，14.67%)>厚壁菌門(Firmicutes，5.14%)>芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，3.51%)>硝化螺旋菌門(Nitrospirae，2.89%)>擬桿菌門(Bacteroidetes，1.20%)>疣微菌門(Verrucomicrobia，1.44%)>浮霉菌門(Planctomycctcs，1.14%)和其他(others)門類(3.63%)；桂輻98-296根際土壤的優勢細菌門分類組成豐度占比排序為變形菌門(32.06%)>放線菌門(26.24%)>綠彎菌門(12.31%)>酸桿菌門(11.15%)>厚壁菌門(Firmicutes，5.89%)>芽單胞菌門(3.18%)>硝化螺旋菌門(2.81%)>擬桿菌門(1.68%)和其他門類(2.93%)；桂糖36號根際土壤的優勢細菌門分類組成豐度占比排序為變形菌門(32.41%)>放線菌門(25.61%)>綠彎菌門(11.97%)>酸桿菌門(11.63%)>厚壁菌門(6.20%)>芽單胞菌門(2.95%)>硝化螺旋菌門(2.23%)>擬桿菌門(1.68%)>疣微菌門(1.05%)和其他門類(3.43%)。可見，與CK相比，2個不同耐旱性甘蔗品種的根際土壤微生物群落豐度組成均發生了變化，其中，2個甘蔗品種根際土壤變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門細菌的豐度占比上升，酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋菌門細菌的豐度占比下降。同時，桂輻98-296根際土壤疣微菌門和浮霉菌門細菌的豐度占比小于1.00%，喪失優勢細菌群落地位，而桂糖36號根際土壤中浮霉菌門細菌的豐度占比亦小于1.00%，同樣喪失了優勢細菌群落地位。

2.3.2 優勢細菌群落在屬分類水平的分析結果 從圖2可看出，在屬分類水平，桂輻98-296、桂糖36號和CK土壤中細菌豐度占比大于1.00%的優勢細菌屬分別有18、17和17個。其中，CK土壤中的優勢細菌屬豐度占比排序為norank_c_Acidobacteria(10.59%)>芽孢桿菌屬(Bacillus，3.00%)>硝化螺旋菌 (Nitrospira，2.89%)>norank_c_KD4-96(2.55%)>norank_o_Gaiellales(2.43%)>H16(2.41%)>norank_f_Gemmatimonadaceae(2.40%)>玫瑰彎菌屬(Roseiflexus，2.35%)>norank_c_Actinobacteria(2.18%)>norank_f_Anaerplineaceae(2.15%)>norank_f_Xanthobacteraceae(2.02%)>norank_f_Nitrosomonadaceae(1.94%)>norank_f_Acidimicrobiales(1.71%)>norank_f_Rhodobiaceae(1.51%)>norank_c_TK10(1.43%)>11-24(1.42%)>norank_f_Rhodospirillaceae(1.38%)和其它(others)屬(43.25%)；桂輻98-296根際土壤的優勢細菌屬豐度占比排順序為norank_c_Acidobacteria(7.11%)>芽孢桿菌屬(3.53%)>硝化螺旋菌屬(2.81%)>H16(2.18%)>norank_f_Gemmatimonadaceae(2.16%)>norank_o_Gaiellales(1.99%)>金霉素鏈霉菌(Streptomyces，1.95%)>norank_c_KD4-96(1.94%)>norank_f_Rhodospirillaceae(1.86%)>norank_f_Acidimicrobiales(1.71%)>玫瑰彎菌屬(1.65%)>norank_f_Anaerplineaceae(1.64%)>norank_o_JG30-KF-CM45(1.61%)>norank_f_Xanthobacteraceae(1.59%)>norank_c_Actinobacteria(1.39%)=norank_f_Nitrosomonadaceae(1.39%)=norank_f_Actinobacteria(1.39%)>馬杜拉菌屬(Actinomadura，1.35%)和其它屬(48.87%)；桂糖36號根際土壤的優勢細菌屬豐度占比排序為norank_c_Acidobacteria(7.34%)>芽孢桿菌屬(3.69%)>硝化螺旋菌屬(2.23%)>norank_f_Rhodospirillaceae(2.20%)>norank_o_Gaiellales(2.01%)>norank_f_Gemmatimonadaceae(1.94%)=norank_c_KD4-96(1.94%)>unclassified_o_Frankiales(1.91%)>H16(1.85%)=玫瑰彎菌屬(1.85%)>馬杜拉菌屬(1.82%)>金霉素鏈霉菌屬(1.68%)>norank_f_Xanthobacteraceae(1.61%)=norank_f_Acidimicrobiales(1.61%)>norank_c_Actinobacteria(1.50%)>norank_f_Anaerplineaceae(1.44%)>norank_o_JG30-KF-CM45(1.40%)和其它屬(48.71%)。可見，與CK土壤相比，馬杜拉菌屬、norank_c_Actinobacteria、unclassified_o_Frankiales和norank_o_JG30-KF-CM45是2個不同耐旱性甘蔗品種根際土壤富集的優勢細菌屬，但同時，2個甘蔗品種根際土壤亦缺失了CK土壤中的11-24、norank_c_TK10和norank_f_Rhodobiaceae等優勢細菌屬；與旱情敏感甘蔗品種桂糖36號相比，norank_f_Nitrosomonadaceae和norank_c_Actinobacteria是耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤特有的優勢細菌屬，但耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤亦缺失了優勢細菌屬unclassified_o_Frankiales。

2.4 物種Venn圖分析結果

從細菌Venn圖(圖3-A)可看出，桂輻98-296、桂糖36號根際土壤和CK土壤在屬分類水平分別有495、493和491屬。其中，三者共有細菌屬472個，桂輻98-296根際土壤特有細菌屬僅1個，桂糖36號根際土壤無特有細菌屬，而CK土壤特有的細菌屬最多，為6個。從圖3-B可看出，桂輻98-296、桂糖36號根際土壤和CK土壤細菌在種分類水平分別有897、892和878種。其中，三者共有細菌種845個，桂輻98-296根際土壤特有細菌種3個，桂糖36號根際土壤特有細菌種僅1個，而CK土壤特有細菌種有6個。可見，根際土壤細菌在屬和種水平的數量均為桂輻98-296多于桂糖36號，且桂輻98-296擁有的特有根際土壤細菌數量多于桂糖36號。說明耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤中擁有比旱情敏感甘蔗品種桂糖36號更豐富的特有細菌種屬可能是其更耐旱的重要原因之一。

2.5 PICRUSt功能預測

基于高通量測序技術分析結果，與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數據庫比對，發現2個不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌基因一級功能層共包含6類生物代謝通路(圖4)，即代謝(Metabolism)、環境信息處理(Environmental information processing)、細胞過程(Cellular processes)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、人類疾病(Human diseases)和有機系統(Organismal systerms)；與CK相比，2個不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌一級功能層的6類代謝通路占比均較高，而桂糖36號根際土壤細菌一級功能層的6類代謝通路占比高于桂輻98-296根際土壤細菌。

由圖5可知，2個不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌基因二級功能層主要由發育(Development)、細胞群落—真核生物(Cellular community-eukaryotes)、信號分子與相互作用(Signaling molecules and interaction)、細胞活性(Cell motility)和核苷酸代謝(Nucleotide metabolism)等46個子功能組成。其中，桂糖36號根際土壤細菌的碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、內分泌系統(Endocrine system)、運輸和分解(Transport and catabolism)、膜運輸(Membrane transport)、核苷酸代謝、感覺系統(Sensory system)及環境適應(Environmental adaptation)等42個二級功能層預測基因拷貝數雖然高于桂輻98-296根際土壤，但細胞活性、細胞群落真核生物、信號分子與相互作用、排泄系統(Excretory system)和發育等功能基因拷貝數則以桂輻98-296根際土壤高于桂糖36號根際土壤相應的功能基因拷貝數，尤其是信號分子與相互作用和發育功能基因拷貝數分別較桂糖36號根際土壤提高10.78%和12.55%。

3 討 論

已有研究發現，脫落酸、細胞分裂素[37]與作物植株耐旱性緊密相關；同時，脫落酸含量與綠彎菌門細菌的豐度占比呈顯著正相關[38]；放線菌門細菌不僅與脫落酸、茉莉酸和水楊酸等抗逆防御類植物激素的總含量呈顯著正相關[38]，而且在干旱脅迫下其相對豐度增加[39]；芽單胞菌門與土壤的干旱程度成正相關[40]。本研究發現，耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤中綠彎菌門、放線菌門和芽單胞菌門細菌的豐度占比均高于旱情敏感甘蔗品種桂糖36號根際土壤相應門類細菌的豐度占比，但變形菌門細菌的豐度占比低于旱情敏感甘蔗品種桂糖36號根際土壤的變形菌門細菌。說明桂輻98-296根際土壤富集了綠彎菌門、放線菌門和芽單胞菌門等具有提高植物抗逆能力的細菌門類，這些功能細菌的富集對提升桂輻98-296的耐旱性具有重要作用。

本研究中，芽孢桿菌屬、norank_c_Acidobacteria、norank_f_Actinobacteria、norank_f_Acidimicrobiales、norank_f_Anaerplineaceae、norank_f_Xanthobacteraceae、norank_f_Rhodospirillacea、norank_c_KD4-96、norank_o_Gaiellales、norank_f_Gemmatimonadaceae、norank_o_JG30-KF-CM45、馬杜拉菌屬、金霉素鏈霉菌屬、玫瑰彎菌屬、H16和硝化螺旋菌屬等細菌屬是2個不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌的共有優勢菌屬。其中，金霉素鏈霉菌屬細菌在耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤中的豐度占比高于旱情敏感甘蔗品種桂糖36號；同時，norank_f_Nitrosomonadaceae和norank_c_Actinobacteria屬細菌是耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤特有的優勢細菌屬；耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤除擁有諸如芽孢桿菌屬等與旱情敏感甘蔗品種桂糖36號一致的有益功能菌屬外，還富集了諸如未分類的放線菌屬、金霉素鏈霉菌屬等優勢細菌屬。已有研究證實，放線菌屬細菌具有提高植物利用水和礦物質[41]、促進植物細胞分裂素和水楊酸合成[42]及通過提高脫落酸和細胞分裂素含量增強植物耐旱能力的作用。本研究中耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤富集了放線菌屬等特有的有益功能優勢菌屬，但旱情敏感甘蔗品種桂糖36根際土壤中缺失了放線菌屬等優勢細菌屬，可能是二者耐旱性存在差異的重要原因之一。

本研究中，2個不同耐旱性甘蔗品種根際土壤細菌的基因一級功能層代謝通路雖然相仿，但耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤細菌的生物功能通路占比及部分細菌基因功能低于旱情敏感甘蔗品種桂糖36號根際土壤細菌，信號分子與相互作用及發育功能基因拷貝數均高于旱情敏感甘蔗品種桂糖36號根際土壤細菌。由此推測，信號分子與相互作用及發育功能更強大的耐旱甘蔗品種一旦遭遇脅迫條件，其根際土壤中細菌的響應速度或能力可能強于旱情敏感甘蔗品種根際土壤細菌，這可能也是桂輻98-296的耐旱性更強的重要原因之一。

本研究在設施中采用盆栽方式探究耐旱和旱情敏感甘蔗品種根際土壤細菌群落組成的差異，若在大田進行，由于難以控制環境條件，不僅不利于比較耐旱程度不同品種根際土壤細菌的組成，而且難以篩查耐旱品種根際土壤中的有益功能菌屬。但試驗在設施中進行，試驗結果并不影響未來將篩選出的有益功能菌屬應用于實際的大面積生產。

4 結 論

與旱情敏感甘蔗品種桂糖36號相比，耐旱甘蔗品種桂輻98-296根際土壤中富集了豐度高占比且具有提高植物抗逆功能的綠彎菌門、放線菌門和芽單胞菌門等優勢細菌門類；同時還富集了未分類的放線菌屬和金霉素鏈霉菌屬等特有優勢細菌屬，并擁有更豐富的信號分子與相互作用功能。桂輻98-296根際土壤中富集的norank_f_Nitrosomonadaceae和norank_c_Actinobacteria等特有優勢細菌屬有望作為提高甘蔗耐旱能力的備選功能菌屬。