生活飲用水中菌落總數新方法應用探究

◎ 謝 俊，白 雪，高 然，趙永旺

（蒙牛乳業（寶雞）有限公司，陜西 寶雞 721013）

水中菌落總數是指水樣在營養瓊脂上，有氧條件下經過37 ℃培養48 h后，每毫升（每克）水樣所含細菌菌落的總數。與生活飲用水有關的衛生問題大多來自于微生物污染，菌落總數作為生活引用水微生物檢測的首選項目，在一定程度上標志著飲用水衛生質量優劣。目前國內常用檢測方法是《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》（GB/T 5750.12—2006）平板傾注法。

2008年菌落總數測試片法在食品領域廣泛應用。本次選擇3M PetrifilmTM菌落總數測試片法進行試驗，其原理為采用可再生的水合物材質，由上下兩層薄膜組成。上層聚丙烯薄膜含有黏合劑、指示劑及冷水可溶性凝膠；下層聚乙烯薄膜含有細菌生長所需的營養瓊脂培養基。細菌在測試片上生長時，細胞代謝產物與上層的指示劑TTC發生氧化還原反應，將指示劑還原成紅色非溶解性產物三苯甲臜，從而使細菌著色。故測試片上紅色菌落判斷為菌落總數。

3M PetrifilmTM菌落總數測試片法檢測生活飲用水中菌落總數含量，對比國標法檢測更便捷，且易于菌落辨別計數；為檢測生活飲用水菌落總數找出一種便捷檢測、且不影響結果準確性的新型方法，也為標準修訂提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

3M PetrifilmTM菌落總數測試片（貨號70200572157，有效期至20220104）；營養瓊脂（批次20190902，有效期3年，密封保存于陰涼干燥處）；3份質控樣品（批次為QC-FD-034的生活飲用水中菌落總數定量分析質控樣，由中國檢驗檢疫科學研究院提供）；2份實驗室間比對樣（批次為20-C448和20-H712，由中國檢驗檢疫科學研究院提供）。

1.1.2 儀器設備

電子天平（百分之一）、電熱恒溫培養箱、滅菌器、超凈工作臺、恒溫水浴箱。

1.2 樣液準備

1.2.1 質控樣品

于無菌環境下開啟凍干樣品西林瓶蓋，立即（1 min內）從220 mL無菌水中吸取20 mL加入西林瓶中將樣品復溶，待樣品粉末溶解后，將溶液吸出轉移至無菌瓶中，再用余下的無菌水反復清洗西林瓶內壁，回收清洗液于上述無菌瓶中，220 mL溶液即為待測水樣樣品原液。

1.2.2 生活飲用水樣品樣液制備

依據《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》（GB/T 5750.12—2006）進行處理。對1.2.1制備后的質控樣品和生活飲用水樣液以無菌操作方法吸取1 mL充分混勻的水樣，注入盛有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶10的稀釋液。吸取l∶10的稀釋液l mL注入盛有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成l∶100稀釋液，并依次稀釋成l∶l 000、l∶10 000稀釋液等備用。每遞增稀釋一次，更換一支l mL滅菌吸管。

1.3 檢測方法

1.3.1 營養瓊脂平板傾注法

依據樣品量及樣本污染情況[1]，在無菌條件下用滅菌吸管取1 mL充分混勻的水樣稀釋液，置于2個無菌平皿內，同時吸取1 mL無菌生理鹽水，做空白對照。傾注15～20 mL已融化并冷卻至45 ℃左右的營養瓊脂培養基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養基充分混勻。待冷卻凝固后翻轉平皿，置于（36±1）℃培養箱中培養48 h，進行菌落計數。

1.3.2 3M PetrifilmTM菌落總數測試片法

依據樣品量及樣本污染情況，在無菌條件下用滅菌吸管取1 mL充分混勻的水樣稀釋液[2]，注入3M PetrifilmTM菌落總數測試片中心位置，蓋下膜后用壓板壓平，每次檢驗時進行平行接種，同時做空白對照。壓板后至少等待1 min，置于（36±1）℃培養箱中培養（48±2）h，進行菌落計數。

1.4 統計方法

使用Mintable軟件進行配對T檢驗分析，P＜0.05具有統計學意義。

1.5 計算方法

質控樣品測試結果依據證書特性值區間進行評價；實驗室間比對質控樣品測試結果采用“穩健統計四分位距計算Z值”進行評價。當|Z|≤2，測試結果滿意；當2＜|Z|＜3，測試結果有問題（可疑）；當|Z|≥3，測試結果不滿意（離群）。

2 結果與分析

2.1 平板傾注法及3M PetrifilmTM測試片法檢測結果及分析

選擇15組自制水樣、3組質控樣、2組實驗室間比對樣分別使用營養瓊脂平板傾注法和3M PetrifilmTM菌落總數測試片法進行檢測，其檢測結果使用精密度和T檢驗進行分析。由表1可知，兩種方法檢測結果的對數差絕對值均＜0.45，表明營養瓊脂平板傾注法和3M PetrifilmTM菌落總數測試片法檢測生活飲用水中菌落總數的差異符合要求。

表1 平板傾注法和3M PetrifilmTM測試片法數據對比分析表

由T檢驗得，平均差的95%置信區間為（-0.069 2，0.122 0），t=0.58，P=0.570＞0.05，表明營養瓊脂平板傾注法和3M PetrifilmTM菌落總數測試片法檢測生活飲用水中菌落總數結果無顯著性差異，見表2。

表2 平板傾注法和3M Petrifilm TM測試片法T檢驗分析表

2.2 質控樣品3M PetrifilmTM菌落總數測試片法檢測結果及分析

由表3可知，質控樣品使用3M PetrifilmTM菌落總數測試片法檢測結果分別為4 000 CFU·mL-1，93CFU·mL-1、88 CFU·mL-1。對照質控樣證書，檢測結果均在證書特性值區間范圍內，表明3M PetrifilmTM測試片法適用于生活飲用水中的菌落總數測定，檢測結果精準。

表3 質控樣品3MPetrifilmTM測試片法菌落總數結果評價表

2.3 實驗室間比對樣3M PetrifilmTM菌落總數測試片法檢測結果及分析

由表4可知，實驗室間比對樣使用3M PetrifilmTM菌落總數測試片法檢測結果分別為1 800 CFU·mL-1、370 CFU·mL-1，使用穩健統計四分位距法計算Z值分別為1.2、1.1，結果評價均為滿意。表明3M PetrifilmTM測試片法適用于生活飲用水中菌落總數測定，檢測結果精準。

表4 實驗室間比對樣3M PetrifilmTM測試片法菌落總數結果評價表

3 結論與討論

（1）試驗結果表明，3M PetrifilmTM菌落總數測試片法檢測生活飲用水中的菌落總數結果與營養瓊脂平板傾注法檢測結果無顯著性差異，從精密度、準確度維度進行評價，均表明3M PetrifilmTM菌落總數測試片適用于生活飲用水中的菌落總數測定。

（2）營養瓊脂平板屬于普通培養基，不具有選擇性。出現特殊菌落、繁殖過快時易造成菌斑重疊覆蓋現象，影響結果計數。而3M PetrifilmTM菌落總數測試片中含有指示劑TTC發生氧化還原反應使細菌著色，呈現紅色斑點，便于計數。具體見圖1、圖2。

圖1 平板法菌落形態圖

圖2 測試片法菌落形態圖

（3）3M PetrifilmTM測試片法檢測過程中減少藥品稱量、配置、滅菌、平皿清洗等環節，培養過程占用面積小，節省空間。適合培養空間小和檢測樣品數量多的實驗機構。

綜上所述，3M PetrifilmTM菌落總數測試片適用于生活飲用水中的菌落總數測定，同時為水質中菌落總數檢測提供了一種便捷易操作的檢測方法。