微小RNA-335-3p靶向小鼠雙微體基因調控骨髓瘤細胞的增殖和凋亡

于云祥，龔泰芳，劉小濤，柯文，李彬彬

骨髓瘤是一種骨髓內單克隆漿細胞異常增殖的惡性腫瘤，其發病率呈增長趨勢，極大威脅人類生命健康。骨髓瘤的治療主要以藥物治療、造血干細胞移植術為主。目前，骨髓瘤的發病機制尚未明確，臨床治療療效不佳。探討骨髓瘤發生和發展的分子機制并尋找該疾病的治療靶點具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類非編碼RNA，參與調控細胞增殖、分化和凋亡等生命過程，在腫瘤的發生發展中起重要作用。有報道稱，miR-335-3p在多發性骨髓瘤病人外周血中表達下調，外周血miR-335-3p 水平變化對骨髓瘤診斷具有重要意義。但是，miR-335-3p 對骨髓瘤發生發展的影響及其作用機制還未知。本研究于2018年5月至2019年1月主要探討了miR-335-3p 對骨髓瘤細胞增殖和凋亡的影響及其可能的調控機制，以期為骨髓瘤的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑

骨髓瘤細胞KM3和U266細胞系購自中科院上海細胞庫；胎牛血清和RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；Trizol試劑和Lipofectamine2000 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒和PCR 試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；引物序列由上海生工生物技術公司提供；miR-335-3p 模擬物（miR-335-3p mimics）以及miRNA 陰性對照購自廣州銳博生物有限公司；噻唑藍（MTT）購自美國Sigma 公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液和BCA 蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；小鼠雙微體基因（MDM2）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（P21）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國Santa Cruz 公司；B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2 相關X（Bax）蛋白抗體購自美國CST 公司；辣根過氧化酶標記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1

細胞培養 復蘇KM3 和U266 細胞，用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養基，置于二氧化碳培養箱中培養。待細胞融合至80% 左右時，進行傳代。正常骨髓細胞MNC 培養：參照文獻[8］方法，采集正常供髓者骨髓，肝素鈉抗凝。加入37 ℃溫浴的2.7% 甲基纖維素，終濃度為0.1%，置于37 ℃、5%二氧化碳、97% 濕度的培養箱中靜置30 min。吸取上層有核細胞層，加入Ficoll-Hypaque 淋巴分離液，2000 r/min 離心30 min，分離MNC 細胞。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2 次，加入含10% 胎牛血清的培養進行培養。

1.2.2

實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測細胞中miR-335-3p 表達水平 用Trizol試劑提取細胞中總RNA，逆轉錄為互補DNA（cDNA）后，行PCR 反應。引物序列：miR-335-3p 正向5'-TTTTTCATTATTGCTCCTGACC-3'，反向5'-GGTCAG GAGCAATAATGAAAAA-3'；U6 正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AC GCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。用2法計算miR-335-3p 相對U6 的表達量。

1.2.3

細胞轉染 取6 孔板，加2.5 mL 對數期KM3細胞懸液（2.5×10/mL），培養12 h 后，用Lipofectamine2000 試劑盒進行轉染。 miR-335-3p 組：轉染miR-335-3p mimics；miR-NC 組：轉染模擬對照序列；pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 組：共轉染MDM2 過表達載體和miR-335-3p mimics；pcDNA3.1+miR-335-3p 組：共轉染空載體和miR-335-3p mimics。轉染6 h 后，更換為完全培養基。再培養24 h，收集細胞用于后續實驗。

1.2.4

MTT 法檢測細胞增殖 取96 孔板，加200μL上述轉染后的細胞懸液（2.5×10/mL），分別培養24 h、48 h和72 h。然后加20 μL MTT（5 g/L）。孵育4 h后，棄培養基。加150 μL 二甲基亞砜溶液，振蕩均勻，于全自動酶標儀490 nm波長處測吸光度。

1.2.5

流式細胞儀檢測細胞凋亡取6 孔板，加2.5 mL 上述轉染后的細胞懸液（2.5×10/mL），培養48 h后，收集細胞。PBS 清洗細胞3 次，利用Annexin VFITC/碘化丙啶（PI）試劑盒，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6

蛋白質印跡法（Western blotting）檢測cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax 和MDM2 蛋白表達 取6 孔板，加2.5 mL 上述轉染后的細胞懸液（2.5×10/mL），培養48 h 后，收集細胞，用RIPA 裂解液提取細胞中總蛋白，BCA 法測定蛋白含量。行10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后，轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并用5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h。 于4 ℃冰箱中分別用cyclin D1（1∶800）、P21（1∶400）、Bcl-2（1∶600）、Bax（1∶600）、MDM2（1∶400）和GAPDH 一抗孵育過夜，洗膜后，再用辣根過氧化酶標記的二抗（1∶200）室溫孵育2 h。加入化學發光試劑，避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。Image J 軟件分析目的蛋白相對GAPDH 的表達量。

1.2.7

雙熒光素酶報告基因實驗 PCR 計數擴增含miR-335-3p 結合位點的MDM2 的3’非翻譯區（UTR），插入載體，構建MDM2 的3’UTR 野生型熒光素酶報告載體（WT-MDM2）；突變結合位點，插入載體，構建MDM2 的3’UTR 突變型熒光素酶報告載體（MUT-MDM2），該過程由上海生工生物技術有限公司完成。用Lipofectamine2000 試劑盒分別將WT-MDM2與miR-335-3p mimics、WT-MDM2與miRNC、MUT-MDM2 與miR-335-3p mimics 及MUTMDM2 與miR-NC 共轉染至KM3 細胞。轉染6 h 后，更換為完全培養基，再培養24 h 后，收集各組細胞，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 骨髓瘤細胞系中miR-335-3p 表達水平

qRTPCR 檢測結果顯示，骨髓瘤細胞KM3 和U266 中miR-335-3p 表達水平分別為0.24±0.01、0.38±0.02，顯著低于正常骨髓細胞MNC 中的miR-335-3p 表達水平0.77±0.03（

t

=29.029、18.735，均

P

＜0.001），

F

=484.929，

P

＜0.001。 由于骨髓瘤細胞KM3 中miR-335-3p 表達水平相對低于U266 細胞（

t

=15.340，

P

＜0.001），因此，選擇KM3細胞進行后續實驗。

2.2 過表達miR-335-3p 對骨髓瘤細胞KM3 增殖的影響

miR-335-3p 組KM3 細胞中miR-335-3p 表達水平為0.48±0.03，高于miR-NC 組的0.21±0.01（

t

=14.789，

P

＜0.001），說明miR-335-3p mimics 轉染成功，KM3 細胞中miR-335-3p 過表達。MTT 法與蛋白質印跡法結果顯示，與miR-NC 組比較，miR-335-3p組KM3 細胞培養48 h、72 h 后吸光度降低（均

P

＜0.05），細胞中cyclin D1 蛋白表達降低（

P

＜0.001），P21 蛋白表達升高（

P

＜0.05），表明過表達miR-335-3p可抑制KM3細胞增殖。見表1。

表1 過表達miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3增殖的影響/±s

2.3 過表達miR-335-3p 對骨髓瘤細胞KM3 凋亡的影響

流式細胞儀與蛋白質印跡法結果顯示，miR-335-3p 組KM3 細胞凋亡率為（24.31±0.99）%，高于miR-NC 組的（8.13±0.83）%（

t

=37.573，

P

＜0.001）；細胞中Bax 蛋白表達水平為（0.71±0.07），高于miR-NC 組的（0.19±0.02）（

t

=106.066，

P

＜0.001）；Bcl-2 蛋白表達水平為（0.32±0.03），低于miR-NC 組的（0.81±0.08）（

t

=110.309，

P

＜0.001），表明過表達miR-335-3p能夠促進KM3細胞凋亡。

2.4 miR-335-3p 靶向調控MDM2

TargetScan 生物信息學軟件預測顯示的MDM2 的3’UTR 與miR-335-3p 互補結合的核苷酸序列見圖1A。共轉染miR-335-3p與WT-MDM2的KM3細胞熒光素酶活性為0.47±0.03，顯著低于共轉染miR-335-3p 與WTMDM2 的0.97±0.05（

t

=14.852，

P

＜0.001）；共轉染miR-335-3p 與MUT-MDM2 的KM3 細胞熒光素酶活性為0.96±0.08，與共轉染miR-NC 與MUT-MDM2 的1.01±0.09 比較差異無統計學意義（

t

=0.719，

P

=0.512），說明miR-335-3p 可與MDM2 的3’UTR 序列結合。miR-335-3p 組MDM2 蛋白表達水平為0.14±0.02，顯著低于miR-NC 組的0.63±0.06（

t

=18.981，

P

＜0.001）；anti-miR-335-3p 組MDM2 蛋白表達水平為0.97±0.06，顯著高于anti-miR-NC 組的0.67±0.04（

t

=7.206，

P

＜0.001）。表明miR-335-3p在KM3細胞中靶向負調控MDM2表達，見圖1B。

圖1 miR-335-3p靶向調控MDM2表達：A為MDM2的3’非翻譯區（UTR）與miR-335-3p互補結合的核苷酸序列；B為miR-335-3p靶向調控MDM2蛋白表達

2.5 過表達MDM2能逆轉miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3 增殖的影響

與pcDNA3.1+miR-335-3p 組比較，pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 組KM3 細胞培養48 h、72 h后吸光度顯著升高（均

P

＜0.05），KM3細胞中cyclin D1 蛋白表達顯著升高（

P

＜0.05），P21 蛋白表達顯著降低（

P

＜0.05），表明過表達MDM2 部分逆轉過表達miR-335-3p 對KM3 細胞增殖的抑制作用。見圖2、表2。

表2 過表達MDM2逆轉miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3增殖的影響/±s

圖2 過表達MDM2逆轉miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3增殖的影響

2.6 過表達MDM2逆轉miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3 凋亡的影響

與pcDNA3.1+miR-335-3p 組比較，pcDNA3.1-MDM2+miR-335-3p 組KM3 細胞的凋亡率顯著降低（

P

＜0.05），Bcl-2蛋白表達顯著升高（

P

＜0.05），Bax蛋白表達顯著降低（

P

＜0.05）。見表3。

表3 過表達MDM2逆轉miR-335-3p對KM3細胞凋亡的影響/±s

3 討論

miRNA 是一類小分子非編碼RNA，對腫瘤的發生發展具有調控作用。研究已顯示，多種miRNA 在骨髓瘤發生發展過程中起重要作用。miR-19a 在多發性骨髓瘤細胞株LP-1 和U266 中表達水平顯著升高，miR-19a 能夠促進骨髓瘤細胞的增殖和侵襲能力，并抑制骨髓瘤細胞的凋亡。多發性骨髓瘤病人血清中miRNA-181a 呈高表達，抑制miRNA-181a表達可降低骨髓瘤RPM18226 細胞的存活、集落形成和遷移能力。miRNA-20a在多發性骨髓瘤病人血漿中表達升高，其可促進骨髓瘤細胞的增殖，抑制骨髓瘤細胞凋亡，促進移植瘤小鼠體內腫瘤生長，是治療多發性骨髓瘤的潛在靶點。研究骨髓瘤病人機體內異常表達的miRNA 及其對骨髓瘤細胞生物學行為的影響，對了解骨髓瘤疾病發生的機制以及臨床基因治療有重要意義。

miR-335-3p 基因定位于7q32.2，參與多種腫瘤的發展進程。Luo 等研究顯示，miR-335-3p 靶向下調聚（ADP-核糖）聚合酶1 表達抑制非小細胞肺癌細胞的遷移和體內腫瘤生長。Wang 等研究顯示，miR-335-3p 過表達對乳腺癌細胞的細胞周期進程、遷移和侵襲具有明顯抑制作用。Gao 等研究顯示，miR-335-3p 在胃癌細胞中表達降低，與胃癌的發生發展密切相關。目前，miR-335-3p 對骨髓瘤細胞增殖和凋亡的研究還未見報道。骨髓瘤的發生與發展是瘤細胞異常增殖和凋亡抑制的結果，通過調控骨髓瘤細胞的增殖和凋亡，可以延緩骨髓瘤的發展進程。本研究結果顯示，miR-335-3p 在骨髓瘤細胞KM3 和U266 中呈低表達，過表達miR-335-3p 對KM3 細胞增殖活性具有明顯抑制作用，而對KM3 細胞凋亡具有明顯促進作用，其可能通過間接調控增殖和凋亡相關蛋白cyclin D1、P21、Bax 和Bcl-2蛋白表達發揮作用，提示miR-335-3p可能成為骨髓瘤基因治療的分子靶標。

miRNA 通常通過調控其靶基因的表達發揮生物學調控作用，為了進一步探討miR-335-3p 影響骨髓瘤細胞增殖和凋亡的分子機制，本研究證實了miR-335-3p 在KM3 細胞中靶向負調控MDM2 表達。MDM2 是一種原癌基因，在膀胱癌、乳腺癌、甲狀腺癌等腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。研究顯示，下調MDM2 表達可抑制神經膠質瘤細胞的增殖和遷移。MDM2蛋白在骨髓瘤組織中表達升高，與病人臨床分期正相關，可能與cmyc 蛋白協同促進骨髓瘤的發展。抑制MDM2 表達可誘導骨髓瘤細胞凋亡，過表達MDM2 可通過激活E2F-1和下調細胞周期抑制蛋白（wtp53和p21）來加速骨髓瘤細胞的細胞周期進程，促進細胞增殖。本研究顯示，過表達MDM2 部分逆轉了過表達miR-335-3p對骨髓瘤細胞KM3增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響，提示miR-335-3p 通過下調MDM2表達抑制骨髓瘤細胞的增殖，并促進其凋亡。

綜上所述，miR-335-3p 在骨髓瘤細胞中呈低表達，其可能通過下調MDM2 表達抑制骨髓瘤細胞的增殖，并促進骨髓瘤細胞凋亡，miR-335-3p/MDM2軸可能為骨髓瘤的治療提供了新靶點，但尚需動物模型實驗在體內驗證miR-335-3p/MDM2 軸對骨髓瘤發生發展的影響。