肝細胞復合體在慢速凍存過程中熱膨脹損傷機理研究

庾曾穎 劉寶林

(上海理工大學生物系統熱科學研究所 上海 200093)

冷凍保存是一種在0 ℃以下長期儲存哺乳動物細胞和組織的方法，在特定溫度下能有效暫停其所有生物過程。懸浮的獨立細胞凍存主要根據不同降溫速率經歷兩種不同損害，即溶液損傷和胞內冰損傷[1-2]，國內外近幾十年的研究已經可以最大程度地減少該形式的損傷[3-4]。而組織工程和再生醫學領域的最新進展已經對貼壁細胞和支架的整體凍存產生需求。有研究表明，經過一系列處理后，將細胞培養于支架上整體凍存，復蘇后細胞的存活率和數量較懸浮細胞有所提升[5]。即這些多維結構的低溫保存可以為人工肝等人工器官提供大量優質、立即可用的細胞。

人工肝支持系統是幫助患者過渡到肝移植，并有助于移植后肝功能恢復的重要治療方法[6]，研究發現生物人工肝的核心是大量優質的肝細胞、良好生物相容性的支架和交換效率高的生物反應器[7]。Li Weijian等[8]利用小分子重新編程技術，直接將人體原代肝細胞轉化為可快速增殖的肝前體細胞，采用氣液交互技術提升反應器交換效率。T.H.Yang 等[9]采用離心固定技術，將細胞懸浮固定于溶液中形成三維立體結構進行低溫保存，提高細胞接種密度。要將人工肝支持系統進一步推廣，建立一個低溫保存的肝細胞庫尤為關鍵[10]。對人工組織的低溫保存可以簡化為黏附于支架材料上的細胞的低溫保存。肝細胞-微載體復合培養是近年來研究和應用較多的高密度肝細胞培養方法[11]，Lu Zekang等[12]利用高壓靜電場和冷凍干燥技術制備了一種具有生物相容性的無毒殼聚糖微載體，具有臨床價值。采用cytodex 3型微載體進行人肝細胞L-02的微載體培養是一種相對簡化的肝細胞體外培養方式，且能夠保持良好的結構與功能表達[13]。研究發現，冷凍保存中細胞脫落與其黏附材料的熱膨脹系數差異有關[14]，但對于熱膨脹損傷的機制未進行明確探討。

本實驗通過測量微載體和貼壁細胞的熱膨脹系數，對比不同凍存方案下兩者的差異，并根據測量結果進行復合體的凍存條件確認，研究熱膨脹損傷的機理，為組織工程和再生醫學領域的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用L-02肝細胞購于上海細胞生物研究所，cytodex 3微載體(直徑133～215 μm，Pharmasia，瑞典)；實驗試劑為RPM1-1640培養液，標準胎牛血清，胰蛋白酶一EDTA消化液(質量分數8%)，購于上海格薪生物科技有限公司；實驗用冷凍保護劑為慢速冷凍保護劑(體積分數10%DMSO)。實驗儀器包括二氧化碳培養箱(上海博訊實業有限公司，中國)、立式壓力蒸汽滅菌器(Tommy有限公司，日本)、Nikon顯微鏡(ECLIPSE 55i，尼康，日本)等。

1.2 實驗方法

1)微載體熱膨脹系數測量及計算

微載體在無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖液(PBS)(每克cytodex加50～100 mL)中復水2 h后，吸取40 μL微載體溶液至6孔板中，靜置吸除上清液后取100 μL保護劑沖洗兩次，靜置達到平衡狀態后，吸取20 μL混合溶液滴至低溫顯微鏡載物臺，調節視野至觀察到清晰明亮的微載體邊緣，通過程序控制降溫速率及終溫，以5 s為間隔拍攝一次照片。

參考王雅博等[15]的方法，采用圖像處理軟件Image-Pro Plus對拍攝的微載體的微球直徑進行測量，根據式(1)計算微載體的體積熱膨脹系數γ。

(1)

由于體積與線度的立方成正比，故：

V=Bx3

(2)

結合微分計算可得：

(3)

式中：γ為體積熱膨脹系數，℃-1；V為微載體體積，cm3；T為溫度，℃；B為比例系數；x為線度，cm。

通過上式可知，體積熱膨脹系數近似等于線性熱膨脹系數的3倍。

2)貼壁細胞熱膨脹系數測量及計算

L-02肝細胞貼壁培養于5 mm細胞爬片上，待細胞所占面積約為60%時進行實驗。將爬片靜置于6孔板中，滴入500 μL保護劑靜置5 min，待其平衡后將爬片置于低溫顯微鏡載物臺，并滴入30 μL保護劑將其覆蓋并加蓋蓋玻片，調節視野至觀察到明亮清晰的細胞邊緣，通過調節系統程序來控制降溫速率與終溫，并以5 s為間隔進行拍照。

采用圖像處理軟件Image-Pro Plus對拍攝的細胞投影面積進行測量，結合式(4)計算細胞面積熱膨脹系數β。

(4)

因為面積與線度的平方成正比，則有：

A=Cx2

(5)

結合微分計算得：

(6)

式中：β為面積熱膨脹系數，℃-1；A為細胞面積，cm2；C為比例系數。

結合上式可知，面積熱膨脹系數近似等于線性熱膨脹系數的2倍。下文涉及的熱膨脹系數均統一轉化為線性熱膨脹系數進行討論。

1.3 肝細胞復合體的培養

根據楊波等[13]的操作，依次進行6孔板硅化處理、微載體乙醇消毒滅菌、接種肝細胞至微載體上、相對靜止培養等操作培養肝細胞復合體。

1.4 肝細胞復合體的低溫保存和復溫

將6孔板中培養2 d的肝細胞復合體移至低溫凍存管中，加載1 mL保護劑，將低溫凍存管放入程序降溫儀中，通過程序控制降溫速率及終溫(參考熱膨脹系數測量實驗中，兩者差異最小時的工況)，進行降溫速率分別為1、2、5 ℃/min的復合體凍存分組實驗，3組實驗的終溫均相同，設置為-6、-10、-14、-18、-22、-26、-30 ℃，達到目標溫度后平衡5 min，取出置于37 ℃水浴鍋中復溫。

1.5 復溫后肝細胞復合體貼壁率、貼壁細胞存活率及總存活率的測定

用AO/PI雙染細胞凋亡檢測試劑檢測凍存復溫后細胞復合體貼壁率、貼壁細胞存活率及總存活率情況。貼壁率和總存活率分別按式(7)和式(8)計算，貼壁細胞存活率按式(9)計算。

(7)

存活率=

(8)

存活率=

(9)

1.6 統計學處理

數據采用SPSS軟件分析，使用GraphPad Prism 6.01軟件繪制圖表。每個樣本重復3次，數據以均數±標準差表示，P<0.05說明差異顯著，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 微載體的熱膨脹系數

基于式(3)計算出不同降溫速率下微載體熱膨脹系數(coefficient of thermal expansion，CTE)如圖1所示。可以看出，同一溫度下，降溫速率越大，微載體的CTE也越大。分析認為對于較快的降溫速率，當溫度降至凝固點時，溶液中形成冰核的數量更多，冰晶快速生長導致微載體內部水分向外遷移更劇烈，表現為宏觀CTE明顯大于1 ℃/min。對同一降溫速率，隨著溫度降低，微載體CTE表現為先逐漸增大，達到峰值后緩慢平穩減小，這可以解釋為對降溫速率較小的微載體，終溫越低時，其收縮能力越小。溶液凍結前，微載體體積的變化主要由微載體的材料性質決定；在降溫至溶液凍結溫度(約-18 ℃)后，微載體的體積由微載體的熱物性和溶液的滲透壓共同影響，此時測量得的CTE為廣義熱膨脹系數。

圖1 微載體熱膨脹系數與降溫速率的關系Fig.1 The relationship between CTE of microcarriers and cooling rate

2.2 肝細胞的熱膨脹系數

肝細胞熱膨脹系數隨降溫速率的變化如圖2所示。與微載體略有不同，細胞的CTE變化程度整體較小。降溫速率較慢時，細胞CTE隨終溫降低而增大，后逐漸趨于平緩；降溫速率較快時，細胞CTE相對穩定。同理，在溶液凍結溫度前后測得的CTE在定義上是有差異的，分別為單純的熱物性參數、由細胞材質和溶液滲透壓共同影響的廣義熱膨脹系數。同一終溫下，細胞CTE隨降溫速率的增大而減小。對同一條曲線(同一降溫速率)，CTE沒有較大的變化，即細胞的膨脹能力并沒有隨終溫的變化而變化，表明細胞在低溫下仍具有正常的膨脹能力。

圖2 肝細胞熱膨脹系數與降溫速率的關系Fig.2 The relationship between CTE of cells and cooling rate

2.3 最小熱膨脹差異

根據上述實驗結果可知，微載體和細胞的熱膨脹系數不僅是溫度的函數，降溫速率對其影響也很大。將同一降溫速率下的微載體與細胞熱膨脹系數變化曲線進行直接對比，篩選出兩者熱膨脹系數差最小的結果，如圖3所示。在較大的降溫速率下，微載體與細胞的熱膨脹系數差異較大。改變降溫速率，兩條曲線出現交點，并在1 ℃/min時呈現較為理想的重合度，差值范圍在(5.22±4.46)×10-4。后續實驗也將圍繞這一實驗條件展開。

圖3 微載體與肝細胞熱膨脹系數差異對比Fig.3 The contrast in CTE of microcarriers and cells at the same final temperature

2.4 肝細胞復合體凍存效果

圖4所示為肝細胞復合體在降溫速率分別為1、2、5 ℃/min時降溫至-30 ℃后，再水浴復溫測得的細胞貼壁率、貼壁細胞存活率及總存活率的情況。顯然，1 ℃/min時細胞各項存活率及貼壁率呈現最優結果，其中貼壁細胞存活率可達90%。這表明在低溫凍存環境下，參考圖3(a)，降溫速率為1 ℃/min的實驗組CTE差異最小，該工況下肝細胞復合體的凍存效果最佳。對比降溫速率為2 ℃/min和5 ℃/min的實驗組，可以看出細胞的貼壁率和總存活率存在差異。這是由于降溫速率會影響溶液凍結瞬間冰晶的生長情況，降溫速率越快，冰晶生長越迅速，產生的機械應力對細胞的黏附狀態破壞更劇烈，進而降低細胞的總存活率。

圖4 降溫速率對復合體貼壁率、存活率的影響Fig.4 The effect of cooling rate on the adhesion rate and survival rate of the hepatocyte microspheres

圖5所示為降溫速率1 ℃/min時，復合體的凍存效果隨終溫的變化。由圖5可知，隨著溫度下降，細胞的貼壁率和存活率也持續下降，降至溶液凍結溫度(約-18 ℃)之前，細胞貼壁率約為60%，溶液中細胞總存活率為70.79%±0.47%。在此期間，影響細胞凍存效果的主要因素即為細胞和微載體間的熱膨脹差異。達到溶液凍結溫度后，貼壁細胞存活率持續降低，貼壁率發生驟降。這是因為在溶液凍結瞬間，胞外冰生長引起的機械損傷或對細胞膜的破壞[16]會造成細胞脫落，影響凍存效果。隨溫度降低，細胞還會遭受由細胞內外溶液滲透壓差引起的滲透損傷。實質上，前文對細胞CTE的測量中，降至凍結溫度后，細胞內外的滲透壓差也會影響貼壁細胞的面積變化，即此時測量的CTE是更廣義的概念，由細胞的熱物性和細胞內外滲透壓共同決定。當溫度降至-26 ℃時，總存活率降至約63.47%±1.44%，貼壁率降低為43.2%±2.13%。

圖5 肝細胞復合體凍存效果Fig.5 Cryopreservation effect of the hepatocyte microspheres

在本實驗的凍結方案下，當溫度在凍結溫度以上時，細胞與微載體的熱膨脹系數差異是影響復合體凍存效果的主要因素。溶液凍結瞬間，胞外冰[17]生長，損傷貼壁細胞的黏附態。當溫度將至凍結溫度以下，細胞存活率大幅降低是滲透損傷[3,18]和熱膨脹損傷的共同結果。

3 討論

黏附細胞的主要冷凍保存損傷模式涉及胞外冰形成、滲透損傷及細胞與基制的熱膨脹差異[19]，且細胞與支架材料間的熱膨脹差異是造成冷凍保存過程中細胞脫落的主要原因之一[14]，但主要研究了損傷現象和存活情況，并未在損傷機制層面進行討論。本文利用低溫顯微鏡來測量低溫下微載體與細胞熱膨脹系數的變化，直接對比測量得到的真實熱膨脹系數，而不是用近似替代值等效分析，能夠更精準的篩選出適宜的凍存條件，優化細胞凍存的效果。

直接對比細胞與微載體的熱膨脹系數，發現降溫速率為1 ℃/min時兩者的差異最小，范圍在(5.22±4.46)×10-4，且該條件下復合體的凍存效果最好(P<0.05，差異顯著)，細胞的總存活率在60%以上，說明熱膨脹差異確實會影響黏附細胞的凍存效果。在溶液凍結溫度以上，細胞與微載體間的熱膨脹差異是細胞凍存效果的主要影響因素；溶液凍結時，胞外冰晶生長對細胞的黏附狀態造成傷害，且降溫速率越快，冰晶生長引起的機械應力越大，胞外冰損傷越強烈；降至溶液凍結溫度以下，熱膨脹系數為廣義的概念，由溶液滲透壓和細胞與微載體的熱物性差異共同影響，表現出的損傷為熱膨脹損傷和滲透損傷的綜合結果。

本文研究了貼壁細胞在低溫凍存條件下的損傷機制，認為黏附細胞在慢速冷凍中主要經歷胞外冰損傷、滲透損傷和熱膨脹損傷，確認熱膨脹損傷是影響肝細胞復合體凍存效果的主要因素之一，對優化細胞及組織的大規模支架培養具有參考價值，為解決人工肝核心問題提供思路。

4 結論

本文通過測量低溫條件下貼壁細胞和微載體的熱膨脹系數，對比并篩選出兩者差異最小時的冷凍條件，根據此工況設計凍存實驗，結合肝細胞復合體在低溫凍存中熱膨脹損傷機制的討論，得到如下結論：

1)實驗確認降溫速率為1 ℃/min熱膨脹差異最小時，細胞的存活率和貼壁率最高，分別為62.66%±0.67%和37.2%±1.25%。

2)在溶液凍結溫度以上，細胞與微載體的熱膨脹系數差異是影響肝細胞復合體凍存效果的主要因素，熱膨脹損傷為主要損傷形式；凍結溫度以下，為廣義的熱膨脹損傷，受溶液滲透壓和細胞與微載體熱物性差異的共同影響。熱膨脹損傷存在于整個降溫過程，細胞與微載體的熱膨脹系數差異是影響復合體凍存效果的重要因素。