貴州山豆根根腐病病原菌鑒定

唐小迪 魏升華 秦睿 崔文艷 何朋杰

摘要：【目的】明確貴州山豆根根腐病的病原菌種類，為山豆根根腐病的防治及抗病育種提供理論基礎。【方法】采用保濕培養法和組織分離法對感染根腐病的山豆根植株組織進行病原菌分離和純化，根據柯赫氏法則對代表性菌株進行致病力測定;結合形態學和分子生物學方法對病原菌進行鑒定。【結果】從收集的病株組織樣本中共分離獲得200株真菌菌株，選取在PDA培養基上菌落形態差異明顯的67株菌株進行ITS測序并在NCBI數據庫進行BLASTn比對分析，結果顯示，67株菌株中包含尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）35株、茄腐鐮刀菌（F. solani）7株、粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）23株和帚狀彎孢聚殼（Eutypella scoparia）2株。致病性測定結果表明，尖孢鐮刀菌代表性菌株和茄腐鐮刀菌代表性菌株均可侵染山豆根引起典型的根腐病癥狀，且茄腐鐮刀菌致病性明顯強于尖孢鐮刀菌。結合形態學特征和分子生物學鑒定結果，確認分離得到的病原菌分別為尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌。【結論】貴州山豆根根腐病主要由尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌復合侵染引起。

關鍵詞：山豆根;根腐病;茄腐鐮刀菌;尖孢鐮刀菌;鑒定;貴州省

中圖分類號：S435.67 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）08-2140-08

Identification of pathogen causing root rot of

Sophora tonkinensis Radix in Guizhou

TANG Xiao-di1， WEI Sheng-hua1， QIN Rui2， CUI Wen-yan1， HE Peng-jie1*

（1Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang ?550025， China; 2Ziyun Autonomous County Changmeng Agricultural Science and Technology Development Co.， Ltd.， Anshun， Guizhou ?550800， China）

Abstract：【Objective】To identify the pathogen causing root rot of Sophora tonkinensis Radix in Guizhou， and to provide a theoretical basis for disease control of S. tonkinensis Radix root rot and for breeding resistant varieties. 【Method】The pathogen causing root rot on S. tonkinensis Radix was isolated and purified from plant samples with root rot disease symptoms. The pathogenicity of representative strains were determined according to Kochs law， and the pathogen strains were identified by morphological characterization and molecular biology. 【Result】According to the collected diseased plant tissues， a total of 200 fungal isolates were obtained from 23 strains out of 67 strains collected， and 67 of them with different growth and morphology characters were selected for ITS sequencing on PDA media， and BLASTN comparison was conducted in NCBI database. There were 35 strains of Fusarium oxysporum， 7 strains of F. solani， 23 strains of Clonostachys rose and 2 strains of Eutypella scoparia. The results of pathogenicity test revealed that representative strains of F. oxysporum and F. solani could infect the root of S. tonkinensis Radix and cause typical symptoms of root rot， and F. solani showed stronger pathogenicity compared with F. oxysporum. In addition， combined with morphological characteristics and molecular biological identification results， the isolated fungal pathogens were identified as F. oxysporum and F. solani， respectively. 【Conclusion】The root rot of S. tonkinensis Radix in Guizhou is mainly caused by simultaneous infection of F. oxysporum and F. solani.

Key words： Sophora tonkinensis Radix; root rot; Fusarium oxysporum; Fusarium solani; identification; Guizhou

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFC1708101）

0 引言

【研究意義】山豆根（Sophorae tonkinensis Radix）又名越南槐、廣豆根，是豆科植物越南槐的干燥根和根狀莖，是我國重要的藥用植物之一（Cai et al.，2018;Ning et al.，2021）。山豆根入藥后具有清熱解毒、消腫利咽的功效，臨床上常用于治療急性咽喉炎和咽喉痛（Ning et al.，2021）。近年來，由于野生資源枯竭，山豆根主要以大面積人工種植為主。自2015年以來，貴州省結合制藥企業對山豆根原材料的需求，先后在紫云縣、興義市、冊享縣和平壩區等地人工種植山豆根667 ha，發現其從種子萌發到采收均容易感染根腐病，尤其在夏秋雨季后發病率最高，且傳染性極強，造成藥材質量和產量的下降。鑒于根腐病對貴州省山豆根產業的嚴重威脅，亟需對其開展系統研究。【前人研究進展】根腐病是由多種病原物侵染引起植物根部腐爛病害的總稱，是一類典型的土傳病害（Basallote-Ureba et al.，2016;Lecomte et al.，2016;Zhang et al.，2016）。在豆科植物中，根腐病主要由真菌和細菌等病原菌引起，且在田間常表現為由不同病原菌復合侵染引起（Misk and Franco，2011;高芬等，2015）。在我國，豆科中草藥根腐病主要由鐮刀菌屬（Fusarium spp.）真菌單獨或復合侵染引起（Chang et al.，2018;Wang et al.，2021），如引起甘草根腐病的主要致病菌為茄腐鐮刀菌（F. solani）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和層出鐮刀菌（F. proliferatum）（曹雪梅等，2014）;引起寧夏六盤山地區蒙古黃芪根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和串珠鐮刀菌（F. moniliforme）（何晨，2015）。周默和白慶榮（2021）對內蒙古莫旗黃芪根腐病病原菌開展研究，證實其主要致病菌為尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌（F. solani）、銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）和木賊鐮刀菌（F. equisetim），與何晨（2015）對寧夏六盤山地區蒙古黃芪根腐病病原菌分離的種類有所不同，說明中草藥根腐病不僅不同寄主的病原菌種類不同，不同產地罹患根腐病的同種中草藥優勢致病菌也存在差異，甚至同一地區不同年份因生態條件不同，其優勢菌種類也可能發生變化。不同的分離方法也會導致不同的結果，劉奕君（2017）采用常規組織分離法從廣西發生甘薯瘡痂病典型癥狀葉片上分離獲得的真菌接種甘薯未見瘡痂病發病癥狀，未能分離到病原菌;于琳等（2020）采用分生孢子懸液梯度稀釋分離法分離病原菌，發現廣東甘薯瘡痂病的病原菌為甘薯痂囊腔菌（Elsinoe batatas）。【本研究切入點】目前，國內尚無針對貴州山豆根根腐病的研究，對引發該病的病原菌尚不明確。【擬解決的關鍵問題】對貴州山豆根種植基地的根腐病發病情況進行調查，初步明確該病害的發生規律;收集典型病株發病組織，通過保濕培養法和組織分離法進行優勢微生物分離和純化，根據柯赫氏法則對代表性菌株進行致病力測定;結合形態學和分子生物學鑒定，確定貴州山豆根根腐病的病原菌種類及生物學和系統發育學特征，為山豆根根腐病的防治及抗病育種打下理論基礎。

1 材料與方法

1. 1 病害調查與樣品采集

2020年8—9月，于貴州省紫云縣中草藥種植基地（海拔1170 m，北緯25°53′6″，東經106°4′9″）對山豆根根腐病發生情況進行調查。采用5點取樣法，每點隨機調查3株山豆根植株，共采集15株樣本，統計并計算山豆根根腐病的發病率。采集典型發病植株，裝于自封袋中帶回實驗室，于4 ℃下保存備用。

1. 2 供試培養基

PDA培養基：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。VBC培養基：KH2PO4 2.0 g，KNO3 1.0 g，蔗糖0.5 g，維生素B l片，維生素C l片，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 L;不加瓊脂即為液體培養基。

1. 3 病原菌的分離、純化與保存

1. 3. 1 保濕培養法分離和純化病原真菌 用無菌剪刀剪切發病山豆根根系樣本，無菌水漂洗干凈。經表面消毒（5%次氯酸鈉溶液消毒1 min，75%乙醇溶液消毒1 min）后將根系樣本用無菌解剖刀和鑷子切成小片，隨機平鋪在含有抗生素（氯霉素10 μg/mL，紅霉素25 μg/mL）的PDA固體培養基中央，每個PDA平板放置1塊，置于28 ℃恒溫培養箱中靜置培養7 d。根據所形成的絲狀真菌形態，挑取絲狀真菌單菌落接種于PDA培養基上進行初次純化。挑取初次純化所得單菌落接種于PDA培養基上進行二次純化，28 ℃靜置培養72 h，觀察培養基上所形成的菌落形態特征。最后用無菌刀片連同菌絲和固體培養基一起切塊放入裝有20%甘油的凍存管中于-20 ℃保存備用。

1. 3. 2 組織分離法分離和純化病原真菌 取染病山豆根組織塊于滅菌研缽中，加入適量無菌水用力研磨，使組織盡可能地磨碎;用梯度稀釋法將所得研磨液分別稀釋103、104、105和106倍;用移液槍吸取300 μL稀釋液涂布至含有抗生素（氯霉素10 μg/mL，紅霉素25 μg/mL）的PDA培養基中，涂布均勻后置于28 ℃培養箱中靜置培養7 d。按照1.3.1的方法分離和純化并保存病原菌菌株。

1. 4 病原菌分子生物學鑒定

取保藏的菌株于新鮮的PDA培養基上28 ℃恒溫活化培養7 d，收集菌絲后加入液氮研磨，使用生工生物工程（上海）股份有限公司的真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取各分離菌株的基因組DNA，于-20 ℃保存備用。

使用特異性引物對ITS1/ITS4（ITS1：5'-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3';ITS4：5'-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系20 μL：Mix 10 μL（百泰克生物技術有限公司），正、反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序：94 ℃預變性4 min 30 s;94 ℃ 40 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進行30個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。獲得的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的代表性菌株序列在NCBI數據庫中用BLASTn進行比對分析，利用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹，確定代表性菌株的分類學地位。

1. 5 病原菌致病性檢測

1. 5. 1 孢子的制備 根據1.4的分子生物學鑒定結果，選取代表性菌株接種于VBC培養基上28 ℃恒溫活化培養5 d，然后加入適量的無菌水洗脫孢子，收集孢子洗脫液后用血球計數板計數，用無菌水調節孢子濃度為1.0×106個/mL的孢子懸浮液，現配現用（張禮維，2015）。

1. 5. 2 離體山豆根組織接種 取健康山豆根根系經表面消毒后用無菌解剖刀切成5 mm厚的薄片，置于預先鋪有2層無菌濾紙的培養皿中;向各培養皿加入約10 mL無菌水，以保持濾紙濕潤;用移液槍吸取待檢測各菌株孢子懸浮液10 μL分別接種于山豆根切片表面，以接種無菌水為陰性對照，每皿放置3片組織薄片，每處理6次重復。將培養皿置于28 ℃恒溫培養箱中保濕培養，分別于培養第3和第7 d觀察并記錄發病情況。

1. 5. 3 活體植物接種 試驗在晝/夜溫度約32 ℃/24 ℃的溫室內進行。將1年生健康山豆根苗移栽至預裝有400 g無菌土的花盆（10 cm×8 cm）中，每盆種植1株，每處理種植10盆;移栽緩苗5 d后用針頭在土壤交界處的根莖部位刺1個小傷口，隨后將孢子懸浮液澆灌至植株根際（陳茂婷等，2020），每盆接種80 mL。每天觀察并記錄山豆根發病情況，分別于第6和第12 d計算根腐病發病率和病情指數。參考李偉等（2011）的分級標準將山豆根根腐病按發病程度分為0～4級：0級，無發病癥狀;1級，發病葉片占全株的1/4以下;2級，發病葉片占全株的1/4～1/2;3級，發病葉片占全株的1/2～3/4;4級，發病葉片占全株的3/4以上。

發病率（%）=病株數/調查總株數×100

病情指數=Σ（各級病株數×相對級數值）/調查

總株數×100

1. 6 病原菌形態觀察

1. 6. 1 菌落形態觀察和菌絲生長速度測定 選取具有較強致病性的代表菌株于PDA培養基中28 ℃恒溫活化培養5 d，用無菌打孔器（直徑6 mm）在菌落邊緣打取菌絲塊，接種至新的PDA培養基中央。將PDA置于28 ℃恒溫培養箱中靜置培養，每日觀察和記錄菌落形態。分析各菌株菌落的質地、菌落形成是否凸起、菌落正/反面顏色以及有無色素滲入培養基等。每株菌株設4個重復。

1. 6. 2 產孢細胞形態觀察和分生孢子大小測定

選取活化培養7 d的代表性菌株，用無菌鑷子夾取菌落表面氣生菌絲，置于光學顯微鏡下觀察產孢細胞和孢子形態。參照1.5.1的方法制備孢子懸浮液，用滴管吸取適量孢子懸浮液于載玻片上，蓋上蓋玻片，轉移至光學顯微鏡下觀察，每株菌株制備3個裝片。于顯微鏡下每個裝片隨機選擇5個視野（100×），每個視野隨機挑取10個孢子，記錄并計算孢子大小。

1. 7 統計分析

試驗數據運用Excel 2010進行統計，運用SPSS 22.0進行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncans新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2. 1 山豆根根腐病的危害與癥狀特點

山豆根從種子萌發到采收約需4年，整個種植期內均可發生根腐病。一般夏、秋雨季（溫度17～32 ℃）植株最易被侵染，田間發病率達15%～40%，死亡率約10%，危害極為嚴重。該病主要危害山豆根的根莖部位，染病部位從根上部逐漸感染至根下部，地上部分表現為葉片變黃、細小，直至整株變黃、萎蔫，甚至全株枯死（圖1）。

2. 2 病原菌分離與ITS序列比對分析結果

從收集的病株組織中共分離得到200株真菌菌株。根據獲得的真菌菌株在PDA培養基上的菌落特征，選取菌落形態差異明顯的67株菌株進行分子生物學鑒定。將測序獲得的ITS序列提交至NCBI數據庫進行BLASTn比對分析，結果（表1）顯示，67株菌株中有35株尖孢鐮刀菌，其分離率最高，為52.24%，其余依次為粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）（23株，分離率34.33%）、茄腐鐮刀菌（7株，分離率10.45%）和帚狀彎孢聚殼（Eutypella scoparia）（2株，分離率2.99%）。

2. 3 病原菌對山豆根的致病性檢測結果

2. 3. 1 離體組織致病性測定 將4種真菌的代表性菌株（帚狀彎孢聚殼菌菌株26-7、粉紅粘帚霉菌菌株30-8、尖孢鐮刀菌菌株13-13和茄腐鐮刀菌菌株27-15）孢子懸浮液接種至山豆根根切片表面，于培養第3和第7 d觀察并記錄離體組織的變化。結果（圖2）表明，不同處理間差異明顯，其中無菌水對照組、菌株26-7和菌株30-8處理組的根切片培養7 d后未觀察到病變現象，根切片表面無菌絲體;菌株13-13和菌株27-15處理組培養7 d后山豆根離體組織表面發生明顯病變或觀察到大量的菌絲體存在。菌株13-13處理組與菌株27-15處理組的根切片病變癥狀存在明顯差異，接種菌株13-13后，第3 d即在離體組織表面觀察到大量白色、細密的菌絲，第7 d菌絲體直徑繼續增大，顏色轉變為粉紅色;接種菌株27-15后，第3 d離體組織表面出現少量發黑腐爛的病斑和菌絲體，第7 d整個組織塊變軟，腐爛發黑，發出腐爛的氣味。

2. 3. 2 活體組織致病性測定 將代表性菌株的孢子懸浮液分別接種至健康山豆根植株根際，結果（圖3）顯示，不同遺傳背景的菌株間致病性差異明顯。分別接種菌株30-8和菌株26-7孢子懸浮液后植株生長正常，連續觀察12 d均未出現根腐病癥狀。分別接種菌株13-13和菌株27-15孢子懸浮液后植株均出現典型的根腐病癥狀，且病情發展速度和癥狀相似，具體表現為：接種后第3 d，部分植株開始出現葉片枯黃癥狀;第3～7 d，植株葉片枯黃比例逐步增加;第7 d，枝葉出現枯黃癥狀;第10～12 d后，葉片掉落，植株地上部逐漸枯萎甚至全部枯死。

為定性分析尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌對山豆根的致病性及差異，統計分析了山豆根接種2種病原菌后的發病率和病情指數。與無菌水對照組相比，山豆根植株接種尖孢鐮刀菌13-13或茄腐鐮刀菌27-15后均出現發病癥狀，且病情惡化速度極快，接種第12 d時發病率和病情指數均分別達100.0%和100.0;植株接種菌株13-13或菌株27-15后病情的發展存在明顯差異，接種后第6 d，菌株27-15處理組發病率和病情指數均顯著高于菌株13-13處理組（表2）。

2. 4 病原菌的培養特性及形態特征

將菌株13-13和菌株27-15轉接至新的PDA培養基上，觀察發現，2株菌株生長均較迅速，菌株27-15培養第3 d能明顯觀察到細密的菌絲，菌絲結合緊密，緊貼于培養基不蓬松，粉紅色，培養10 d左右即可鋪滿培養基（圖4-C）;菌株13-13培養第2 d即能明顯觀察到培養皿上有白色薄絮狀菌絲，菌絲蓬松，后期轉為淡粉色，培養7 d左右可鋪滿培養基（圖4-A）。

在光學顯微鏡下觀察2株病原菌菌株的顯微結構，發現菌株13-13產孢透明，孢子形態有差異，為卵形、腎形和圓形，大小為3.1～23.1 μm×1.5～7.7 μm，平均為13.1 ?m×4.6 ?m（圖4-B）;菌株27-15的孢子有大型分生和小型分生2種孢子之分，孢子不透明，小型分生孢子與大型分生孢子數量幾近相等，小型分生孢子梭形，大型分生孢子呈鐮刀形，細長，孢子大小為3.1～61.5 μm×1.5～5.1 μm，平均為32.3 μm×3.3 μm（圖4-D）。

2. 5 病原菌遺傳進化分析結果

用ITS1和ITS4引物對分別對菌株13-13和菌株27-15進行rDNA-ITS序列擴增，經測序后獲得的序列長度分別為475和514 bp。將拼接的2段序列依次輸入NCBI進行BLAST同源性比對，結果顯示分別與尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌的同源性為99%。根據BLAST比對結果，選取同源性較高的菌株序列，基于真菌rDNA-ITS序列構建系統發育進化樹，結果（圖5）表明，菌株13-13和菌株27-15分別與菌株F. oxysporum strain CB54和F. solain isolate ZB11263610的遺傳距離最近，聚為一類。向GenBank提交菌株13-13和菌株27-15對應序列，分別得到登陸號SUB10331849和SUB10331864。綜合形態和分子鑒定結果，確定菌株13-13為尖孢鐮刀菌，菌株27-15為茄腐鐮刀菌。

3 討論

本課題組調查發現，由于單一品種多年連作，同時貴州省地處我國西南山區，常年濕潤多雨，山豆根根腐病發病率和致死率均逐年升高，近年來發病率和致死率已分別高達15%～40%和10%。山豆根的入藥部位為根部，發生根腐病后，山豆根的產量和品質均受到嚴重影響，給當地中藥材產業帶來嚴重的經濟損失。根腐病根據致病物的差異主要可分為細菌性根腐病和真菌性根腐病（Misk and Franco，2011;高芬等，2015;Zhang et al.，2016）。本研究在采集病株時發現，與健康山豆根根系相比，染病山豆根根部表面分布有細密的菌絲，暗示貴州省山豆根根腐病可能主要由病原真菌引起。通過保濕培養法和組織分離法，從山豆根發病組織中共分離獲得200株真菌，結合分子生物學和形態學鑒定及回接試驗驗證，最終確定貴州山豆根根腐病由尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌混合侵染引起。覃柳燕等（2010）采用常規組織分離法從廣西發生根腐病典型癥狀的山豆根根部分離出的病原菌為茄腐鐮刀菌。本研究結果與其相似，明確茄腐鐮刀菌是引起山豆根根腐病的主要致病菌之一;同時，本研究首次證實尖孢鐮刀菌也是引起山豆根根腐病的主要病因之一。

尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌均屬鐮刀菌屬，寄主范圍和地理分布廣泛，能侵染多種中藥材、農作物及觀賞植物，如黃芪（鄧成貴，2005）、蘆薈（姬廣海等，2007）、小麥（李偉等，2011）、白及（孫樂樂等2013）、甘草（曹雪梅等，2014）、百合（邊小榮等，2016）、鷹嘴豆（Zaim et al.，2018）、西瓜（束秀玉，2020）和煙草（姚健等，2020）等，引起植物根腐病或枯萎病。這2種病原菌的菌絲體或厚垣孢子能借助土壤、栽培基質及植物殘體過冬，當外界環境適宜時，再通過植株根際和莖基部或其他傷口入侵為害（Chen et al.，2017;Yu et al.，2017）。山豆根在生長發育過程中，由于次生根系分化和發育，導致傷口出現，進而造成病原物入侵，引發如根腐病等根、莖基部病害。本研究結果表明，在山豆根離體組織和活體植株上，尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌均可獨立或協同引起根腐病癥狀。進一步研究發現，無論是室內活體試驗還是溫室盆栽試驗，茄腐鐮刀菌的致病力均明顯高于尖孢鐮刀菌，其中，室內活體試驗中茄腐鐮刀菌侵染組織橫切面的癥狀與田間病株患病莖基部切面完全一致，呈黑色，根部軟，輕捏容易變形，而尖孢鐮刀菌接種后主要表現為長出茂密的菌絲，根部輕捏不變形，背對接種的菌面呈健康的淡黃色;盆栽試驗中，2種病原真菌均可致病，癥狀相似，但茄腐鐮刀菌處理組根腐病發病速度明顯快于尖孢鐮刀菌處理組。綜合以上試驗結果，田間條件下貴州山豆根根腐病雖然由2種病原菌復合侵染引起，但相關癥狀主要由茄腐鐮刀菌引發，可能與茄腐鐮刀菌的侵染速度和致病性高于尖孢鐮刀菌有關。Wang等（2021）研究表明，2種以上不同種鐮刀菌混合接種對玉米植株的致病性較單一病原菌接種強、發病率高且潛育期縮短。有關尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌侵染方式的差異、混合接種與單獨接種的癥狀區別及兩者的致病機制等均有待進一步探究。

4 結論

通過病原菌的形態特征觀察、致病力測定，結合ITS序列分析，明確貴州山豆根根腐病主要由尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀復合侵染引起。研究結果豐富了山豆根根腐病致病真菌種類，也為貴州山豆根根腐病病害的綜合防控提供了理論基礎。

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（責任編輯 麻小燕）

收稿日期：2021-07-02

基金項目：國家重點研發計劃項目（2018YFC1708101）

通訊作者：何朋杰（1988-），https：//orcid.org/0000-0003-4379-9126，博士，主要從事中藥材病害生物防治研究工作，E-mail：gzhepj 2006@163.com

第一作者：唐小迪（1997-），https：//orcid.org/0000-0003-4460-6138，研究方向為中藥材病害生物防治，E-mail：806920640@qq.com