都柳江易危魚類小口白甲魚種群遺傳多樣性的AFLP分析

安丹丹 代應貴 韓雪

摘要：【目的】從分子水平揭示珠江水系都柳江小口白甲魚種群遺傳結構和多樣性的特點，探討其致危原因及機制，為開展小口白甲魚種群保護提供科學依據。【方法】于貴州境內都柳江三都、興華和榕江3個采樣點共采集30尾小口白甲魚，篩選8個引物組合對都柳江小口白甲魚種群全基因組DNA進行AFLP分析，采用PopGene32進行位點總數和多態位點數統計，并計算Shannons信息指數（I）、Nei基因多樣性指數（H）、多態信息含量（PIC）、觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）及個體遺傳距離（DA）等遺傳參數。【結果】采用8個引物組合從都柳江小口白甲魚種群中共擴增出699條擴增片段，片段長度為69～500 bp，平均每個引物組合擴增獲得87.38個位點。在699個擴增位點中，有663個位點為多態位點，多態位點數占總位點數的94.85%。699個擴增位點在30尾都柳江小口白甲魚個體中的出現頻率可劃分為10個區間，其中，頻率區間30%～89%的擴增位點數差異不明顯，而頻率區間0～9%和90%～99%的擴增位點數出現峰值。都柳江小口白甲魚種群的I、H、PIC、Na、Ne平均值分別為0.3490、0.2206、0.6404、1.9464和1.3574，個體間的DA為0.2305～0.4440，平均為0.3304;基于DA構建的都柳江小口白甲魚種群UPGMA系統進化樹顯示，30尾都柳江小口白甲魚聚成兩大分支，即個體18單獨聚為一個分支，而其余29尾都柳江小口白甲魚個體聚為另一分支。【結論】都柳江小口白甲魚種群遺傳多樣性豐富，但存在有效種群規模變小及有效等位基因丟失的現象，推測其為生態瀕危物種，應采取相關措施對都柳江小口白甲魚種群進行科學保護。

關鍵詞： 小口白甲魚;群體遺傳多樣性;AFLP分析;多態位點;都柳江

中圖分類號： S965.199 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）08-2294-08

AFLP analysis of genetic diversity in population of vulnerable species Onychostoma lini from Duliu River

AN Dan-dan1， DAI Ying-gui1，2*， HAN Xue1

（1College of Animal Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2Special Fisheries

Research Institute， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract：【Objective】To clarify the genetic structure and diversity of Onychostoma lini population from the Duliu River in the Pearl River system， and explore the endangered mechanism， and provide reference for protection countermeasures of the species. 【Method】The genetic diversity of whole genome DNA in the 30 individuals of O. lini collected in the river in Sandu， Xinghua and Rongjiang of Guizhou was analyzed by the methods of AFLP using 8 selected primer pairs， the parameters for genetic diversity including total number of amplified locus， number of amplified polymorphic locus， Shannons information index（I）， Neis gene diversity index（H）， polymorphism information content（PIC）， number of observed allele（Na）， number of effective allele （Ne） and genetic distance（DA） were calculated by PopGene32. 【Result】A total of 699 amplification fragments comprising 69-500 bp respectively were amplified using the 8 primer pairs. On average， 87.38 sites were obtained for each primer combination amplification. Among the 699 amplification sites， ?663 were polymorphic loci accounting for 94.85% of the total. The 699 amplified loci were distributed in 10 intervals of occurrence frequency of locus in the 30 individuals of O. lini from the Duliu River. Of them， the number of amplified locus changed slightly in interval of occurrence frequency of 30%-89% but those in intervals of occurrence frequency of 0%-9% and 90%-99% both occurred peak values. The values of I， H， PIC， Na and Ne in the population averaged ? 0.3490， 0.2206， 0.6404， 1.9464 and 1.3574， respectively. The DA of the 30 individuals ranged from 0.2305 to 0.4440， with an average of 0.3304. The UPGMA phylogenetic tree of the population based on DA ?showed that， ?the 30 individuals was clustered into 2 branches based on the genetic distance， 18 individuals was clustered into a branch and the rest 29 into another. 【Conclusion】The population of O. lini from the Duliu River contained high genetic diversity， but the effective population size had become small and some effective alleles had been lost in the population， and therefore O. lini might be an ecologically endangered species. It is necessary to take measures to protect the O. lini population in the Duliu River.

Key words： Onychostoma lini; population genetic diversity; AFLP analysis; polymorphic site; Duliu River

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（30760189，30960297）; Scientific and Technological Project of Guizhou（QiankeheJ〔2007〕2062）

0 引言

【研究意義】小口白甲魚（Onychostoma lini）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鲃亞科（Barbinae）白甲魚屬（Onychostoma），主要分布在我國沅江水系、汀江、九龍江及珠江下游水系，為淡水名優野生經濟魚類（代應貴等，2010）。近年來，受人類活動的影響，小口白甲魚野生資源瀕臨枯竭，已被列為易危魚類（汪松和解焱，2004）。在貴州境內，小口白甲魚僅殘存分布于長江水系清水江和珠江水系都柳江部分河段（代應貴和陳毅峰，2007），其種群數量非常稀少。遺傳多樣性是指種內不同群體或同一群體內不同個體遺傳變異的總和，是生物多樣性的基礎（陳靈芝，1993）。種群遺傳多樣性是評價物種在自然壓力下生存能力的重要指標（Erickson et al.，2004）。在物種適應生存環境變化的過程中，低水平的遺傳多樣性常伴隨著雜合度降低和近交衰退，進而制約種群對環境變化的適應能力和進化潛力，增加種群滅絕的風險（Erickson er al.，2004;佟廣香等，2009;施雯等，2010）。開展生物種群遺傳多樣性研究不僅可揭示物種進化的歷史，還能為進一步分析其進化潛力和未來命運提供證據，尤其有助于對物種稀有或瀕危原因及其過程進行探討（陳珊珊和周明芹，2010）。因此，檢測和評估受威脅魚類種群遺傳多樣性，可分析其自然生境適應能力并揭示致危原因和機制，進而提出科學的保護策略。【前人研究進展】擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）是荷蘭科學家于1995年提出研究群體遺傳變異的成熟分子標記技術，具有所需DNA量少、可重復性好、多態性檢測靈敏及無需了解其遺傳背景等優點（李秀詩等，2019;廖秋石等，2020）。該技術是基于限制性酶切和PCR的全基因組DNA擴增片段長度多態性檢測方法，克服了限制性片段長度多態性（RFLP）復雜和隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）穩定性差的缺點，但保留了RFLP重復性高及PCR簡便快捷等優點（馬召騰和潘連德，2011）。韓志強等（2007）采用AFLP、RAPD及Cytb基因序列分析等3種方法研究半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）群體的遺傳變異，結果表明AFLP分子標記對群體遺傳變異的檢測較其他2種方法更靈敏。近年來，AFLP分子標記更多應用于水產動物群體遺傳結構及多樣性分析（Sharifi et al.，2015;孫苗苗等，2017;Napora-Rutkowski et al.，2017;劉良國等，2018）。陳見等（2014）采用AFLP分子標記對翹嘴鲌（Erythroculter ilishaeformis，♀）、黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda，♂）及其雜種F1群體進行遺傳差異分析;Sharifi等（2015）采用AFLP分子標記研究波斯灣對阿巴斯、布什爾和阿巴丹近岸海域烏鲹（Parastromateus niger）3個群體的親緣關系和系統進化，結果表明這3個波斯灣烏鲹群體分屬不同種群;劉祥芳等（2017）基于AFLP技術在太湖野生翹嘴鲌群體中篩選出雌、雄性個體的特異分子標記，并進行性別連鎖基因及其轉換標記研究;閆學春等（2018）利用AFLP分子標記證實外源基因組DNA可通過顯微注射方式整合到鯽（Carassius auratus）的基因組中，從而獲得轉基因鯽。【本研究切入點】小口白甲魚為我國特有魚類和重要經濟魚類，但該物種正面臨著種群數量減少和分布區急劇縮小的趨勢，且有關小口白甲魚分子標記或多態性的研究報道極少，僅見代應貴等（2010）采用DNA測序技術對都柳江小口白甲魚種群進行mtDNA D環序列變異及遺傳多樣性分析。因此，從不同角度對都柳江小口白甲魚種群的遺傳多樣性進行系統評估，進而開展其野生種群的恢復與保護顯得十分迫切。【擬解決的關鍵問題】應用AFLP分子標記基于全基因組進行珠江水系都柳江小口白甲魚種群遺傳變異分析，從分子水平揭示其種群遺傳結構和多樣性的特點，探討小口白甲魚致危原因及機制，為開展小口白甲魚種群保護提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集及全基因組DNA提取

供試都柳江小口白甲魚以刺網采自貴州境內都柳江三都至榕江河段（圖1），在三都、興華和榕江3個采樣點分別采集5、10和15尾，共計30尾。都柳江小口白甲魚捕獲后解剖取其肌肉樣品，并以乙醇保存備用。肌肉樣品采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒[DP324-02，天根生化科技（北京）有限公司]進行全基因組DNA提取。

1. 2 AFLP分析

AFLP分析所用的接頭和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，限制性內切酶EcoR I（B300140-0005）/Mse I（B300224-0300）、T4 DNA連接酶（B600511-0002）、dNTP（B300576-0200）、Taq DNA聚合酶（B600001-0200）及10×Buffer（B300048-0005）也購自生工生物工程（上海）股份有限公司。經預試驗篩選出8個引物組合（表1）對都柳江小口白甲魚種群全基因組DNA進行AFLP分析。

1. 2. 1 限制性酶切與連接反應 ?酶切反應體系20.0 μL：DNA模板4.0 μL，Adapter 1.0 μL，EcoR I/Mse I 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，T4 DNA連接酶1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，混勻后離心數秒。酶切程序：37 ℃ 5 h，8 ℃ 4 h，4 ℃過夜。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。

1. 2. 2 預擴增 PCR反應體系25.0 μL：DNA模板 2.0 μL，PreAmp Mix（預擴引物）1.0 μL，dNTPs 1.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 18.0 μL，混勻后離心數秒。擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，進行30個循環;72 ℃延伸5 min。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測預擴增產物。

1. 2. 3 選擇性擴增 預擴增產物按1∶20稀釋后作為擴增模板。PCR反應體系25.0 μL：預擴增產物稀釋樣品2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，EcoR I/Mse I各1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，混勻后離心數秒。擴增程序：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s;再進行12個循環，每個循環的退火溫度遞減0.7 ℃;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，進行23個循環。PCR擴增產物4 ℃保存備用。

1. 2. 4 電泳 采用貝克曼庫爾特公司的CEQ8000遺傳分析系統，運用熒光標記和毛細管電泳分離技術，將PCR擴增產物在毛細管中進行電泳分離，以激光激發熒光采集數據，電泳結果通過CEQ8000遺傳分析系統自帶軟件自動統計分析并轉換成“0，1”矩陣，保存于Excel表格供數據處理。

1. 3 數據處理

采用PopGene32進行位點總數和多態位點數統計，計算Shannons信息指數（I）、Nei基因多樣性指數（H）、觀測等位基因數（Na）和有效等位基因數（Ne）等遺傳參數。根據公式PIC=∑（1-Pi2）/n計算多態信息含量（PIC），其中Pi為任一引物組合擴增獲得第i條條帶在所有供試材料中出現的頻率;參照Nei等（1983）的方法計算個體間的遺傳距離（DA），并基于DA采用MEGA 6.0構建都柳江小口白甲魚種群UPGMA系統進化樹。

2 結果與分析

2. 1 都柳江小口白甲魚種群AFLP擴增結果

經預試驗篩選，選擇8個引物組合（表1）對都柳江小口白甲魚基因組進行擴增，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得多態性豐富、成像清晰而穩定的電泳條帶，即AFLP擴增圖譜（圖2）。

采用8個引物組合對都柳江小口白甲魚種群（30尾）基因組進行擴增，共獲得699條擴增片段，片段長度為69～500 bp（表2）。每個引物組合擴增獲得的片段數在54～121條，平均為87.38條。以引物組合8得到的擴增片段數最少（54條），而引物組合2得到的擴增片段數最多（121條）。每個引物組合擴增獲得的基因型數在29～30個，平均為29.50個。

2. 2 都柳江小口白甲魚種群遺傳多樣性分析結果

在都柳江小口白甲魚種群中，8個引物組合共擴增出699個位點，平均為87.38個位點（表3）。在699個擴增位點中，有663個位點為多態位點，多態位點數占總位點數的94.85%。8個引物組合的多態位點數在50～111個，多態位點比例為86.30%～98.91%，平均為94.64%。以引物組合5擴增獲得的多態位點數最多（111個），而引物組合8擴增獲得的多態位點數最少（50個）;引物組合4擴增獲得的多態位點比例最高（98.91%），而引物組合2擴增獲得的多態位點比例最低（86.30%）。8個引物組合擴增的共有位點數為1～10個，平均為4.50個。都柳江小口白甲魚種群的I、H、PIC、Na、Ne平均值分別為0.3490、0.2206、0.6404、1.9464和1.3574（表3）。

699個擴增位點在30尾都柳江小口白甲魚個體中的出現頻率可劃分為10個區間：0～9%、10%～19%、20%～29%、30%～39%、40%～49%、50%～59%、60%～69%、70%～79%、80%～89%、90%～99%和位點頻率為100%的關鍵點（圖3）。其中，頻率區間30%～89%的擴增位點數差異不明顯，而頻率區間0～9%和90%～99%的擴增位點數出現峰值。

2. 3 都柳江小口白甲魚種群的聚類分析結果

30尾都柳江小口白甲魚個體間的DA為0.2305～0.4440，平均為0.3304。基于DA構建的都柳江小口白甲魚種群UPGMA系統進化樹（圖4）顯示，30尾都柳江小口白甲魚聚成兩大分支。其中，個體18單獨聚為一個分支，而其余29尾都柳江小口白甲魚聚為另一分支。

3 討論

遺傳多樣性可反映種內遺傳變異水平，是衡量種群生存、進化及其對環境條件適應的關鍵指標（陳靈芝，1993）。豐富的遺傳多樣性決定了物種的進化潛力及適應環境變化的能力，有助于保持物種和整個生態系統的多樣性（陳珊珊和周明芹，2010）。多態位點比例是評價群體遺傳多樣性的特征參數（佟廣香等，2009）。若群體中同一引物組合擴增多態位點數占總位點數的比例超過50%，即認為該群體具有較豐富的遺傳多樣性（陳良華等，2009）。本研究以篩選出的8個引物組合對都柳江小口白甲魚種群進行AFLP擴增，獲得的多態位點數占總位點數的86.3%～98.91%，平均為94.64%，顯著高于長江合江江段的巖原鯉（Procypris rabaudi）群體（37.50%～68.57%）（宋君等，2005）和黑龍江水系呼瑪河的野生哲羅魚群體（43.64%～55.64%）（佟廣香等，2009），也高于洞庭湖庫區（85.41%）和沅水下游（83.25%）的黃顙魚（Pelteobagrus nitidus）群體（劉良國等，2018），表明都柳江小口白甲魚種群具有較豐富的遺傳變異。I 和H是反映群體遺傳變異的常用指標，其數值越高則表明遺傳變異越大，群體遺傳多樣性越高（佟廣香等，2009）。本研究中，都柳江小口白甲魚種群的I為0.2862～0.3969（平均為0.3490），H為0.1713～0.2585（平均為0.2206），分別高于黑龍江水系呼瑪河哲羅魚群體（I=0.2215，H=0.1480）（佟廣香等，2009）、烏蘇里江尖吻細鱗鮭（Brachymystax lenok）群體（I=0.1985，H=0.1364）（王荻等，2010）及鰱（Hypophthalmichthys molitrix）長江水系邗江群體、老河群體、珠江群體和黑龍江群體（I=0.0784～0.1051，H=0.0481～0.0661）（嚴駿驄等，2010）等，進一步說明都柳江小口白甲魚種群具有較高的遺傳多樣性。當PIC≥0.50時擴增位點為高度多態性位點，0.25

Na與Ne間的差異越小，表明該等位基因在群體內分布的均勻度越高（戴習林等，2017）。都柳江小口白甲魚種群的Na在1.8630～1.9891，平均為1.9464;Ne在1.2645～1.4326，平均為1.3574，即Na明顯高于Ne，表明該種群中等位基因分布的均勻度較低，存在有效種群規模變小且有效等位基因丟失的現象。都柳江蘊藏著豐富的水力資源，其干流自三都以下河段現已規劃17級航電開發樞紐（曹孟智，2016），其中在榕江縣、三都縣境內分別修建的永福電站（趙景志等，2016）和白梓橋電站已實現截流發電，水電站大壩的修建對壩址上下游河段產生了阻隔效應，導致其水域生境片段化，阻斷了小口白甲魚的洄游路徑。這可能是導致都柳江小口白甲魚有效種群規模變小、有效等位基因丟失的主要原因。瀕危物種、狹窄物種和特有物種的種群普遍處于較低的遺傳多樣性水平（Ellstrand and Elam，1993）。小口白甲魚已被列為易危物種（汪松和解焱，2004），但本研究結果表明都柳江小口白甲魚種群仍保存著較豐富的遺傳多樣性，故推測都柳江小口白甲魚屬于生態瀕危物種，因此建議采取有針對性的對策積極開展其種群資源保護：（1）保護都柳江河流生境，對河流沿岸村莊、集鎮、縣城進行垃圾無害化處理和污水處理，防止對都柳江造成水質污染，以滿足小口白甲魚對棲息水域水質的要求;（2）在都柳江開展水利工程建設時須進行環評論證，確保不會對小口白甲魚種群造成負面影響，如建設水電站大壩時應修建過魚通道等配套工程以免阻斷小口白甲魚的洄游路徑;（3）加大對都柳江小口白甲魚種群的保護力度，實行禁漁期、禁漁區制度，嚴格執法，最大限度地減小人為捕撈的影響;（4）對野生小口白甲魚進行人工馴養繁殖試驗，積極開展小口白甲魚人工增殖放流;（5）開展都柳江小口白甲魚種群動態監測及保護生物學研究。

進行群體遺傳學評價時，樣本充分采集是準確評估群體遺傳結構的前提條件，檢測樣本量及分子標記的選用直接影響遺傳評估效率（戴習林等，2017）。在珍稀瀕危魚類種群遺傳學研究中，常因種群數量稀少而無法采集到較大數量的試驗樣本。Sj?gren和Wy?ni（1994）通過計算機模擬運算發現，樣本量和等位基因位點數過少會導致檢測群體遺傳變異偏低，甚至檢測不到變異。李思發（1998）應用同工酶技術進行淡水魚類種質資源研究時發現，供試群體樣本量應大于30尾。張繼全等（1998a，1998b）基于計算機模擬和中國黃牛（Bos taurus）品種實例分析，認為基因位點數和樣本量是影響群體遺傳距離估測精度的主要因素。劉麗等（2005）通過對40尾勒氏笛鯛（Lutjanus russellii）的DNA進行RAPD分析，結果發現調查樣本量應達20尾且位點數應達70個才能保證研究結果的可靠性。戴習林等（2017）對羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）種群的SSR分析也顯示樣本量及分子標記量對種群遺傳多樣性指標有顯著影響，而性別對群體遺傳多樣性指標無顯著性影響，當樣本量大于30尾、分子標記位點數大于25個時，群體各遺傳參數值趨于穩定。

AFLP是一種成熟的種群遺傳多樣性檢測方法，其技術要求用于群體遺傳多樣性分析的樣本量要足夠多，然而在實際操作中受研究規模、經費和時間限制、可供分析基因位點的豐富性及標本樣品可獲得性等因素的影響，常導致用于研究的群體樣本量只能維持在一定水平。周藝彪等（2005）對湖北釘螺（Oncomelania hupensis）種群遺傳多樣性的AFLP分析結果表明，當試驗樣本量超過30只、基因位點總數超過338個時，其種群遺傳多樣性指標值趨于穩定。由于水域生境破壞及人為過度捕撈的影響，小口白甲魚在都柳江目前僅殘存分布于三都至榕江江段，種群數量極少。本研究在三都至榕江河段不同采集點共計采集30尾小口白甲魚，通過AFLP技術標記出669個基因位點，其研究結果能反映該種群遺傳多樣性水平的現狀，具有較高的可信度。由于群體遺傳多樣性的準確測定受樣本量、擴增位點數及分子標記等多種因素的影響（周藝彪等，2005;戴習林等，2017），因此今后可通過增加樣本量、擴增位點數及采用其他分子標記對都柳江小口白甲魚種群遺傳多樣性進行更深入的研究。

4 結論

都柳江小口白甲魚種群遺傳多樣性豐富，但存在有效種群規模變小及有效等位基因丟失的現象，推測其為生態瀕危物種，應采取相關措施對都柳江小口白甲魚種群進行科學保護。

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（責任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2020-07-28

基金項目：國家自然科學基金項目（30760189，30960297）;貴州省科學技術基金項目（黔科合J字〔2007〕2062）

通訊作者：代應貴（1968-），https：//orcid.org/0000-0001-6104-7671，教授，主要從事水產生物種質資源研究工作，E-mail：daiygui@163.com

第一作者：安丹丹（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-2674-0889，研究方向為水產動物種質資源學，E-mail：2479277157@qq.com