廣西產羅漢松葉指紋圖譜研究

陳明偉 韋錦梅 甄丹丹 丘琴 盧顯興 黃秋艷 甄漢深

摘要：【目的】以廣西產羅漢松[Podocarpus macrophyllus （Thunb.） D. Don]的葉為研究對象，建立高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為羅漢松葉的質量評價提供參考依據。【方法】利用HPLC對廣西產羅漢松葉進行指紋圖譜研究，建立共有模式，并進行方法學考察，使用相似度評價系統對10批不同產地羅漢松葉的共有峰進行確認，對其相似度進行評價;使用SPSS 21.0，以共有峰原始峰面積數據進行聚類分析。【結果】方法學考察結果中，精密度試驗主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（RSD）均小于3%;穩定性試驗相對峰面積的RSD均小于3%，表明樣品提取液在24 h內較穩定;重復性試驗所有色譜峰的相對保留時間的RSD均小于2%;建立羅漢松葉的指紋圖譜，10批不同產地羅漢松葉初步建立其共有模式，標定了22個共有峰，樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度都在0.900以上，相似性良好。在10批羅漢松葉藥材的指紋圖譜中，共有峰的相對保留時間無明顯差異。10批羅漢松葉樣品可分為3類：S4為第1類;S3、S2和S1為第2類;S5、S6、S7、S8、S9和S10為第3類。【結論】建立的羅漢松葉指紋圖譜特征性強，準確可靠，可為羅漢松葉的質量評價提供參考依據。

關鍵詞： 羅漢松葉;質量分析;指紋圖譜;高效液相色譜（HPLC）

中圖分類號： S791.46;R284.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）08-2078-09

Fingerprint of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don

leaves from Guangxi

CHEN Ming-wei， WEI Jin-mei， ZHEN Dan-dan， QIU Qin*， LU Xian-xing，

HUANG Qiu-yan， ZHEN Han-shen

（Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning ?530200， China）

Abstract：【Objective】The high efficiency liquid chromatography（HPLC） fingerprint was adopted to analyze leaves of Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don. from Guangxi，so as to provide a reference for the quality evaluation of leaves of P. macrophyllus. 【Method】HPLC was used to study the fingerprint of P. macrophyllus leaves and the common fingerprint mode was established，the method validation was carried. The similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM（2012.1 edition） was used to calculate the similar degree of common peaks of 10 batches of P. macrophyllus leaves from different places of origins. The SPSS 21.0 statistical software was used to cluster the original peak area data of the common peaks. 【Result】In precision tests，relative standard deviation（RSD） of relative retention time and relative peak area of the major common peaks were less than 3%. RSD of relative peak area in stability tests are all less than 3%，the results showed that the sample extract was stable within 24 h. RSD of the relative retention time of all chromatographic peaks in the reproducibility tests were less than 2%. The fingerprints of the leaves of P. macrophyllus were established. The common fingerprint pattern of 10 batches of P. macrophyllus leaves were initially established，22 common peaks were confirmed. The similarity between the fingerprint of the sample and the control was more than 0.900，the similarity was good. There was no great difference in the relative retention time of the common peaks among 10 batches of P.macrophyllus leaves. The 10 batches of P. macrophyllus leaves could be divided into 3 categories. S4 into the first category，S3，S2 and S1 were grouped into the second category，S5，S6，S7，S8，S9 and S10 were grouped into the third category.【Conclusion】The fingerprint established is characterized，accuracy and reliability，which can provide basis for the quality evaluation of the P. macrophyllus leaves.

Key words： Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don leaves; quality analysis; fingerprint; high efficiency liquid chromatography（HPLC）

Foundation item： Guangxi First-class Discipline Construction Project（2018XK052）; Zhuang and Yao Pharmaceutical Collaborative Innovation Center Project（Guijiaokeyan〔2013〕20）; Guangxi Zhuang and Yao Medicine Key Laboratory Project（Guikejizi〔2014〕32）; Guangxi Key Discipline Zhuang Pharmacy Project（Guijiaokeyan〔2013〕16）

0 引言

【研究意義】羅漢松[Podocarpus macrophyllus（Thunb.） D. Don]又名羅漢柏、羅漢杉、金錢松、長青羅漢杉、土杉、仙柏等，為羅漢松科羅漢松屬植物，分布在熱帶、亞熱帶和南溫帶地區，在廣西地區常見。羅漢松既可作觀賞植物，又可作藥用植物，其全株均可藥用（吳魯東等，2012;張東峰，2020），其中穗花杉雙黃酮為羅漢松的主要活性成分（黃振青等，2014;楊雨等，2014）。穗花杉雙黃酮是近年來發現的具有多種生物活性的化合物，具有抗炎（黃振青等，2014）、抗微生物（Hwang et al.，2012;Wilsky et al.，2012）、抗輻射（Lee et al.，2012）、抗腫瘤（Bochis et al.，2015;Pan et al.，2017;Lee et al.，2018;王曜暉等，2019）、護肝（黃振青等，2014）、神經保護（Ishola et al.，2012，2013）及降血糖（鄭曉珂等，2013）等作用。隨著植物類藥物活性單體研究的不斷深入，穗花杉雙黃酮的作用越來越引起各國學者的廣泛關注，羅漢松的藥用價值也顯示出更廣闊的前景。因此，以穗花杉雙黃酮為主成分，建立廣西產羅漢松葉高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究的方法，可為羅漢松葉的鑒別及質量控制提供科學依據。【前人研究進展】目前，有關羅漢松的研究多集中在藥理作用和化學成分提取方面。陳永鈞等（2013）研究表明，羅漢松的乙醇提取物具有體外抗氧化活性。周燕等（2014）研究發現，羅漢松種子提取物對人胃癌細胞MGC-803有明顯的體外抑制作用，其抑制作用與藥物的質量濃度和作用時間呈正相關;之后通過藥物體外試驗，進一步明確了羅漢松種子對人胃癌細胞MGC-803發揮抑制作用的生物活性部位為其95%乙醇提取部位（周燕，2015）。隗磊等（2015）研究發現，不同濃度的羅漢松實醇提物具有降血脂、保肝及抗氧化作用。王彬（2016）從羅漢松枝葉的95%乙醇提取物中分離鑒定出23個化合物，并發現二萜類化合物inumakilactone A對腫瘤細胞Hela和OS-RC-2具有較強的增殖抑制活性。趙凱麗和黃增瓊（2018）采用氣相色譜—質譜法（GC-MS）對羅漢松種子揮發油的化學成分進行分析鑒定，結果發現羅漢松種子揮發油中含有大量的川芎嗪（四甲基吡嗪），相對百分含量高達97.27%，提示川芎嗪是羅漢松種子治療心胃痛的物質基礎。袁堂豐等（2019）采用響應面法優化得到羅漢松總二萜的最佳提取工藝參數為：甲醇濃度80.00%、提取溫度63.0 ℃、液料比26∶1（mL/g），此工藝下羅漢松總二萜得率為1.13%;提取到的羅漢松總二萜對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子具有不同的清除能力，最大清除率分別為81.71%、66.27%和38.60%。【本研究切入點】目前有關羅漢松的質量控制方法較少，吳魯東等（2012）對其進行了性狀、顯微和薄層方面的鑒別，尚未見指紋圖譜的研究報道。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，基本反映中藥材或中成藥的化學成分和含量分布情況，是評價藥材質量較全面的方法，目前已廣泛應用于多種中藥的質量控制中（丘琴等，2017;黃紅泓等，2019;陳林杰等，2020;崔譽文等，2020;童培珍等，2020）。液相色譜法具有簡便準確、靈敏度高、重復性好、檢測器種類多等特點，是構建指紋圖譜的重要方法之一。本研究以廣西不同產地的10批羅漢松葉為研究對象，以穗花杉雙黃酮為參照峰，建立羅漢松葉HPLC指紋圖譜，對羅漢松葉進行質量分析，可科學評價羅漢松葉的質量。【擬解決的關鍵問題】建立羅漢松葉HPLC指紋圖譜共有模式，使用相似度評價系統對10批廣西不同產地羅漢松葉的共有峰進行確認，并對其相似度進行評價;使用SPSS 21.0，以共有峰原始峰面積數據進行聚類分析，以期為從整體上控制羅漢松葉的質量提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

10批羅漢松葉藥材采自廣西不同產地，經馬利飛副主任中藥師（廣西一心藥業醫藥有限責任公司）鑒定為羅漢松科羅漢松屬羅漢松（P. macrophyllus）的葉，藥材信息見表1。95%乙醇、磷酸（20120315，AR）和冰醋酸（20160108，AR）購自國藥集團化學試劑有限公司，甲醇（色譜醇）購自Fisher公司，穗花杉雙黃酮（批號：170109）購自上海融禾醫藥科技發展有限公司。主要儀器設備：Agilent-1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）;Millipore Simplicity-185超純水儀（美國密里博公司）;KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;BP211D分析天平[德國賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1. 2 供試品溶液制備

精密稱取羅漢松葉粉末（通過3號篩）約1 g，加95%乙醇溶液30 mL置于錐形瓶中，搖勻，稱定，80 ℃回流提取2 h，放冷，補足減失的重量，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容至2 mL容量瓶中，用0.22 μm微孔濾膜過濾，制備得供試品溶液。

1. 3 對照品溶液制備

取穗花杉雙黃酮對照品，精密稱定10.0 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，得穗花杉雙黃酮對照品溶液，濃度為2 mg/mL;精密量取穗花杉雙黃酮對照品溶液2 mL至5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為0.8 mg/mL的穗花杉雙黃酮對照品溶液;再精密量取上述穗花杉雙黃酮對照品溶液0.127 mL，置于2 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，得濃度為0.0508 mg/mL的穗花杉雙黃酮對照品溶液。

1. 4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry? C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）;流動相：甲醇—0.1%磷酸;檢測波長：320 nm;流速：1 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：10 μL;洗脫程序見表2。

1. 5 系統適用性試驗

分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，按1.4的色譜條件進樣測定分析，檢測HPLC系統對有效成分的分離效果。

1. 6 方法學考察

通過預試驗可知，羅漢松葉中含芹菜素和穗花杉雙黃酮，其中穗花杉雙黃酮含量較高，峰面積較大，分離度較好，峰型較高，因此選擇穗花杉雙黃酮作為參照峰。

1. 6. 1 精密度試驗 取羅漢松葉樣品（那坡縣）約1 g，按1.2的方法制備供試品溶液，再按1.4的色譜條件連續進樣6次測定，計算HPLC圖譜中各個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的相對標準偏差（RSD），以檢測儀器的精密度。

1. 6. 2 穩定性試驗 精密稱取同一份羅漢松葉樣品1 g，按1.2的方法制備供試品溶液，分別在不同的時間點（0、2、4、8、12和24 h）按1.4的色譜條件進樣分析，分別計算HPLC圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，以測定該樣品的穩定性。

1. 6. 3 重復性試驗 精密稱取同一批羅漢松葉樣品6份，每份1 g，按1.2的方法制備供試品溶液，按1.4的色譜條件進樣分析，分別計算HPLC圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，測定分析方法重復性。

1. 7 樣品指紋圖譜測定

精密稱取10批廣西不同產地的羅漢松葉粉末各1 g，按照1.2的方法制備供試品溶液，再根據1.4的色譜條件進樣分析，記錄10批不同產地羅漢松葉HPLC圖。將不同產地的10批羅漢松葉HPLC圖譜數據錄入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723版），設置參比峰和時間窗后進行自動化匹配及相似度計算，得到各產地樣品測定的指紋圖譜。

1. 8 特征圖譜構建

通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723版）確定各樣品的共有特征峰，構建各樣品的羅漢松葉高效液相特征圖譜。

1. 9 相似度評價

對10批不同產地羅漢松葉的指紋圖譜，使用多點校正法，以對照圖譜為參照，以中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723版）進行相似度評價，從而對10批不同產地羅漢松葉的指紋圖譜進行相似度計算。

1. 10 聚類分析

以10批羅漢松葉藥材的共有峰峰面積為原始數據，應用組間連接的聚類方法，利用SPSS 21.0進行聚類分析。

2 結果與分析

2. 1 系統適用性試驗結果

羅漢松葉供試品的色譜圖顯示峰形良好，基線平穩，相鄰峰之間分離良好，沒有溶劑峰及雜質峰的出現;穗花杉雙黃酮對照品峰形良好，出峰保留時間在52 min左右（圖1）。

2. 2 方法學考察結果

2. 2. 1 精密度試驗結果 對羅漢松葉供試品溶液檢測分析后發現，符合HPLC指紋圖譜的分析要求，其主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明儀器的精密度良好。

2. 2. 2 穩定性試驗結果 對羅漢松葉供試品溶液檢測分析后發現，其主要共有峰的相對峰面積RSD均小于3%，相對保留時間的RSD均小于2%，表明樣品提取液在24 h內較穩定，可用于檢測。

2. 2. 3 重復性試驗結果 對羅漢松葉供試品溶液檢測分析后發現，以穗花杉雙黃酮（6號色譜峰）為參照峰，所有色譜峰相對保留時間的RSD均小于2%，相對峰面積的RSD均小于3%，均符合指紋圖譜要求，表明HPLC法建立廣西產羅漢松葉指紋圖譜重復性良好。

2. 3 羅漢松葉指紋圖譜測定結果

以北海市樣品（S10）的指紋圖譜作為參照指紋圖譜，10批羅漢松葉樣品的色譜圖如圖2所示，共有26個共有特征峰被確定，其中22個共有峰具有特征明顯，穩定性好，吸收峰強的特點，選其為共有峰;穗花杉雙黃酮（6號色譜峰）在各樣品色譜圖中的穩定性較好，可作為參照峰。通過指紋圖譜可比較出10個產地中羅漢松葉含有的共有峰，以確定不同產地羅漢松葉中可能含有的相同物質。

2. 4 特征圖譜的建立

利用相似度評價系統構建羅漢松葉提取物的特征圖譜（圖3），22個共有峰的峰面積及保留時間見表3。以穗花杉雙黃酮（6號色譜峰）作為參照峰，其保留時間和峰面積設為1.0000，計算其他各共有峰的相對保留時間（表4）和相對峰面積（表5），并計算10個產地羅漢松葉提取物非共有峰面積與總峰面積百分比（表6）。由表4和表5可知，在10批羅漢松葉藥材的指紋圖譜中，各共有峰相對保留時間的RSD為0.05%～0.96%，表明各產地間樣品共有峰出峰時間較穩定;而相對峰面積的RSD為3.17%～48.13%，表明廣西不同產地羅漢松葉的成分含量有較大差異。

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（責任編輯 羅 麗）

收稿日期：2020-04-28

基金項目：廣西一流學科建設項目（2018XK052）;壯瑤藥協同創新中心項目（桂教科研〔2013〕20號）;廣西壯瑤藥重點實驗室項目（桂科基字〔2014〕32號）;廣西重點學科壯藥學項目（桂教科研〔2013〕16號）

通訊作者：丘琴（1983-），https：//orcid.org/0000-0002-3908-9685，博士，教授，主要從事藥學和中藥學的教學及科研工作，E-mail：12031983@163.com

第一作者：陳明偉（1977-），https：//orcid.org/0000-0001-6952-6930，副教授，主要從事中藥活性成分及質量控制研究工作，E-mail：262584687@ qq.com