王曉英

（福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002）

1 引言

李斯特氏菌為革蘭氏陽性菌，呈圓尾帶狀，是一種非芽孢兼性厭氧菌[1]，有6個種：單核細胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes,LM）、（綿羊）伊氏李斯特氏菌（L.ivanovii）、斯氏李斯特氏菌（L.seeligeri）、格氏李斯特氏菌（L.grayi）、威氏李斯特氏菌（L.welshimeri）、英諾克李斯特氏菌（L.innocua）[2]。這些菌中，只有單核細胞增生李斯特氏菌能引起人畜共患病[3]。單核細胞增生李斯特氏菌，簡稱“單增李斯特氏菌”，常見于乳制品、肉類、禽類等食品中，易引起新生兒腦膜炎、孕婦流產、成人敗血癥等疾病，多發于免疫缺陷患者、妊娠婦女、老人和新生兒[4]。其中孕婦感染比健康成年人高達20倍，2001年，美國將其列為法定上報疾病[5]。國內感染單增李斯特氏菌報告數量呈上升趨勢，主要以新生兒和孕婦為主[6]。GB 29921—2013《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》規定熟肉制品和即食生肉制品中不得檢出單增李斯特氏菌[7]，因此，單增李斯特氏菌快速、精準檢測顯得尤為重要。

本文從單增李斯特氏菌國標檢測方法和VITEK 2 Compact 30全自動微生物鑒定系統應用兩方面對食品中單增李斯特氏菌檢測展開分析，找出檢測關鍵點并提出單增李斯特氏菌快速、精準檢測的對策建議。

2 國標檢測法分析

2.1 LB1和LB2選擇性增菌

LB 1和LB2均為選擇性增菌液體培養基，含有萘啶酮酸，廣譜抗菌，尤其對革蘭氏陰性桿菌的抑制生長能力明顯。多數情況下，可疑菌經LB1增菌培養后進行選擇性分離即可被檢測到，但LB2增菌必不可少，因為樣品中如果可疑菌含量低而競爭菌含量高，且可疑菌活力很低，需要通過LB2二次增菌培養以提高單增李斯特氏菌的檢出率。

2.2 選擇性平板分離

2.2.1 PALCAM瓊脂培養基

PALCAM 瓊脂除提供必要營養外，七葉苷經李斯特氏菌水解后，與Fe2+反應形成黑色的6,7-二羥基香豆素；氯化鋰和其他的抗生素能抑制G-和大多數G+。李斯特氏菌屬均可水解七葉苷（表1），在PALCAM瓊脂培養基上均為圓形、灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈。因此，當樣品中混雜除單增李斯特氏菌以外的李斯特氏菌屬菌種時，PALCAM瓊脂培養基無法快速篩選出單增李斯特氏菌。

2.2.2 顯色培養基

李斯特氏菌顯色培養基，均含有一些細菌特異性酶的顯色底物，檢驗人員可根據菌落顏色或是否有乳白色暈環等對可疑菌做出快速篩選，可極大提高單增李斯特氏菌的檢出率和準確性。HKListeria和CHROMagar Listeria對單增李斯特氏菌基本無抑制作用，可根據菌落顏色和形態直接對單增李斯特氏菌進行分離篩選。其具有較高靈敏度、特異性和選擇性，是非常有效的選擇性分離培養基。一般情況下，單增李斯特氏菌在HKListeria呈現藍綠色菌落，在CHROMagar Listeria有明顯的白色暈環（圖1）。為避免出現假陽性，檢測人員可將可疑菌分離純化后輔以木糖、鼠李糖試驗初步確證。

圖1 單增李斯特氏菌顯色培養基菌落形態

2.3 木糖、鼠李糖試驗

從顯色平板上選取可疑菌進行木糖、鼠李糖試驗，單增李斯特氏菌木糖陰性、鼠李糖陽性，英諾克李斯特氏菌木糖陰性、鼠李糖反應不定。因此，通常情況下，除英諾克李斯特氏菌外，其它李斯特氏菌均可與單增李斯特氏菌快速區分（表1）。選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養物繼續進行后續的生化鑒定。

表1 單增李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區別

3 VITEK 2 Compact 30鑒定分析

目前，VITEK 2 Compact 30已成為食品微生物檢驗檢測可疑菌鑒定的“金標準”，檢測人員在可疑菌的鑒定環節普遍采用VITEK 2 Compact 30全自動微生物鑒定系統代替傳統生化實驗。然而，當前測試卡反應底物下，單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌反應類型極為相似，僅PIPLC反應存在差別（表2）。因此，顯色培養基上的單增李斯特氏菌可疑菌落經VITEK 2 Compact 30鑒定后，結果有可能被誤定為英諾克李斯特氏菌，且可信度達到可接受水平（≥85%），嚴重影響了檢測人員對可疑菌的準確檢出。類似情況，國內的多家檢測機構在參加檢驗機構能力驗證中均有遇到。筆者咨詢儀器售后服務工程師后，認為可能是VITEK 2 Compact 30分析軟件版本的影響，也可能是菌株生長狀態的差異。

表2 單增李斯特氏菌VITEK 2 COMPACT反應情況

4 檢測關鍵點和對策建議

綜上，食品中單增李斯特氏菌檢測關鍵在于區分英諾克李斯特氏菌和單增李斯特氏菌。國標法雖然操作復雜、耗時長，但仍是目前公認的最可靠的方法。為了準確區分英諾克李斯特氏菌和單增李斯特氏菌，本文在傳統國標法基礎上進行改進（圖2）。檢測人員可用SN/T 5224—2019《出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢驗方法 實時熒光PCR內標法》[8]對LB2增菌液進行快速篩查以初步判斷是否含單增李斯特氏菌。顯色平板上分離所得可疑菌接種木糖和鼠李糖并進行溶血試驗，同時劃線TSA-YE平板充分純化。一般情況下，單增李斯特氏菌在新鮮血平板上具有清晰、狹窄、明亮的溶血圈。選擇具有明顯溶血的TSA-YE培養純菌落通過VITEK 2 Compact 30全自動微生物鑒定系統和API Listeria測試卡鑒定。在VITEK 2 Compact 30鑒定結果與顯色培養基菌落形態、溶血實驗和熒光PCR檢測結果均不一致的情況下，以API Listeria測試卡補充鑒定實驗結果為最終判斷標準。

圖2 單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗程序

5 討論

單增李斯特氏菌是一種重要的食源性致病菌，廣泛分布于自然界中，當人食用污染有單增李斯特氏菌的食物后，極易發病，尤其對新生兒、老年人、孕婦等免疫力低下者。WHO已將單增李斯特氏菌列為四大食源性致病菌之一[9]。國標檢測法對樣品進行選擇性增菌，然后根據顯色平板上的特征性菌落分離單增李斯特氏菌，再經過一系列生化試驗進行確證，所需設備要求、成本低，但操作性強，對檢驗人員檢測法的掌握程度要求高。筆者認為，在傳統國標檢測法基礎上輔以一些快速檢測設備如熒光PCR進行初篩是單增李斯特氏菌檢測的有效手段。另外，國標檢測法中顯色培養基的應用至關重要，國產的有HKListeria，進口的有CHROMagar Listeria，單增李斯特氏菌菌落特征明顯，可有效分離出可疑菌。單增李斯特氏菌具有獨特的溶血特征，對于顯色培養基上的可疑菌落先做溶血實驗，綜合溶血、木糖、鼠李糖反應結果進行可疑菌落的后續鑒定，可大大增強目標菌選擇的準確性。API Listeria測試卡中的DIM孔是梅里埃的專利，用于檢測房基酰胺酶，專門用于區分單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌，可等同或替代VITEK 2 Compact 30的鑒定結果[10]。再者，表1中所列是李斯特氏菌屬典型菌株的生化反應特征，但有些菌株某些反應類型具有差異，如少數單增李斯特菌溶血實驗為陰性（ATCC 15313），少數英諾克李斯特菌木糖發酵實驗結果為陽性（CICC 10416）等，檢驗人員不能單純通過表1或某個生化實驗結果來確認或排除某一種李斯特氏菌，需同時采用多種方法進行綜合判斷。