“高粱不育系Tx623A×蘇丹草Sa”RIL 群體農藝性狀的QTL 定位

王麗華，陸葉飛，陸以靜，劉言龍，李杰勤

（安徽科技學院農學院，安徽鳳陽 233100）

高丹草作為高粱×蘇丹草雜交種（Sorghum bicolor×Sorghum sudanense），是一種以收獲莖稈、葉片為主的飼用作物[1]。我國高丹草遺傳研究從20 世紀90 年代陳才夫等[2]開始蘇丹草×擬高粱種間雜種的細胞學分析，到現在多個遺傳連鎖圖譜的構建及性狀定位等[3-5]，已取得了一些成就。

株高、穗長、分蘗、莖粗、單株鮮質量和單株干質量等性狀是與產量緊密相關的重要農藝性狀，這些性狀的QTL（Quantitative Trait Locus）定位已在水稻[6]、玉米[7]、小麥[8]、大豆[9]、油菜[10]、高粱[11]、花生[12]等作物中有相關研究，但高丹草相關農藝性狀QTL 定位研究較少，于肖夏等[13]以170 個F2單株為作圖群體，利用50 對SSR 引物構建了高丹草分子遺傳圖譜，并對莖粗、葉寬等8 個性狀進行QTL定位。石悅等[3-4]利用305 個F2分離單株和444 個AFLP 標記構建了高丹草分子遺傳圖譜，并對莖粗、葉片數、分蘗數等農藝性狀進行了QTL 定位分析。房永雨等[5]利用高丹草F2分離群體構建了包含284 個AFLP 標記的分子遺傳圖譜，并對氫氰酸、單株干質量、株高等10 個性狀進行QTL 定位分析。LU 等[14]利用248 株F2∶3單株構建了包含178 個標記（170 個AFLP，8 個RAPD）的高丹草分子遺傳圖譜，并對株高、莖粗、葉片數等10 個農藝性狀進行QTL定位。

本研究利用在親本間具有多態性的138 個SSR 標記對株高、莖粗、穗長、分蘗數、單株鮮質量、單株干質量6 個農藝性狀進行QTL 定位，構建高丹草RIL 群體遺傳圖譜，對高丹草分子標記輔助選擇育種具有指導意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以高粱不育系Tx623A 為母本、蘇丹草恢復系Sa為父本[15]和雜交F9的126 個RIL 群體為試驗材料。

1.2 試驗方法

試驗在安徽省鳳陽縣安徽科技學院進行。于2018 年5 月20 日種植，小區采用隨機區組排列，種植密度為50 cm×25 cm，每行10 株，3 次重復，常規田間管理。

1.2.1 農藝性狀測定 植株成熟后親本和126 個RIL 群體株系分別隨機選取5 株測定株高、莖粗、穗長、分蘗數、單株鮮質量和單株干質量[16]。

1.2.2 DNA 提取和SSR 標記分析 采用SDS（十二烷基硫酸鈉）法[17]提取父母本（各2 株）和126 株RIL群體株系的植株葉片，通過實驗室現有的1050 個SSR 標記對親本進行多態性篩選。PCR 反應體系如表1 所示，PCR 程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；72 ℃延伸7 min 結束。利用濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR 產物。銀染后讀膠，母本帶型記作“1”，父本帶型記作“2”，雜合帶型記作“3”，缺失記作“-”。

表1 PCR 擴增反應體系

1.3 數據分析

通過Joinmap 4.0 軟件來構建遺傳連鎖圖譜。第一步：建立數據文件，將Loc 文件轉到Joinmap 狀態下。第二步：利用LOD Groupings 命令分組，LOD 值默認為2～10。使用Greate Groups for mapping 命令作圖，通過Kosambi 函數計算遺傳圖譜的距離[18]，使用QTL IciMapping 4.0 軟件定位產量相關性狀的QTL 位點。QTL 命名方法：q+性狀英文首字母+所在染色體。

2 結果與分析

2.1 RIL 群體6 個農藝性狀表型值分布特征

對親本和RIL 群體的6 個農藝性狀表型進行比較分析（表2），RIL 群體的平均株高為（133.92±48.05）cm，高于母本Tx623A 的株高，但低于父本株高和雙親平均株高；莖粗的平均值為（14.72±2.58）mm，遠低于母本Tx623A，且低于雙親莖粗的平均值；單株鮮質量和單株干質量均低于雙親的單株鮮質量和單株干質量；穗長低于雙親穗長均值；分蘗數高于母本Tx623A，但遠低于雙親分蘗數均值。株高、莖粗、穗長、分蘗數、單株鮮質量和單株干質量6 個農藝性狀的偏度和峰度都不大，均呈連續性正態分布，適合進行QTL 定位分析。

表2 RIL 群體及親本農藝性狀的測定結果

2.2 RIL 群體農藝性狀相關性分析

對6 個農藝性狀進行相關性分析，結果表明（表3），除莖粗外，株高、穗長、分蘗數與其他4 個性狀均呈極顯著正相關。株高和單株鮮質量、單株干質量、穗長、分蘗數均呈極顯著正相關，其中，株高與單株鮮質量的相關系數最大（r＝0.645）；單株鮮質量和單株干質量、穗長、分蘗數呈極顯著正相關，其中，單株鮮質量與單株干質量相關系數最大（r＝0.571）；單株干質量和穗長、分蘗數呈極顯著正相關。莖粗和株高、穗長、分蘗數呈負相關。

表3 RIL 群體6 個農藝性狀的相關性分析

2.3 RIL 群體的分子遺傳圖譜構建

用1 050 個SSR 標記進行親本間的多態性篩選。經鑒定共有192 對引物能擴增出清晰的條帶且在2 個親本間表現多態，多態性比例為18.29%。以篩選出的多態性引物對RIL 群體進行PCR 擴增和檢測（圖1），其中138 對引物成功用于構建連鎖圖譜。構建的遺傳圖譜總長度為1 606.7 cM，標記間平均距離為11.6 cM（圖2）。1 號染色體上的標記最多，共有31 個；9 號染色體上的標記最少，僅有6 個。

2.4 重要農藝性狀的QTL 分析

由表4 可知，本研究共檢測到60 個QTL 位點，解釋14.05%～68.58%的表型差異。其中，控制株高的QTL 位點有4 個，分別位于4、5、6 號染色體上，可以解釋24.75%～33.59%表型變異，LOD 值為4.56～5.60；qPH-5 位于5 號染色體，定位于S59-GS321 之間，其加性效應為正值（5.47），表型貢獻率為27.02%，其他位點加性效應均為負值。控制穗長的QTL 位點有27 個，單個QTL 解釋14.05%～68.58%表型變異，LOD 值為4.57～31.73。qEL-1 位于1 號染色體，定位于GS53-GS93 之間，加性效應為正值，表型貢獻率為68.58%；qEL-5 位于5 號染色體，定位于S15-S56 之間，加性效應為正值（11.88），表型貢獻率為29.40%。控制分蘗數的QTL 位點有1 個，位于5 號染色體，定位于S15-S56 之間，該位點表現出負加性效應，表型貢獻率為30.39%。控制單株鮮質量的QTL 位點有13 個，單個QTL 解釋17.69%～36.40%表型變異，LOD 值為4.52～8.18。控制單株干質量的QTL 位點有15 個，單個QTL 解釋20.32%～30.48%表型變異，LOD 值為5.15～9.77，單株鮮質量和單株干質量均表現負加性效應。未檢測到控制莖粗的QTL 位點。

表4 RIL 群體的QTL 分析

續表4

更重要的是，8 個QTL 位點同時控制多個農藝性狀。5 號染色體的S15-S56 區間控制穗長、分蘗數、單株干質量和單株鮮質量。3 號染色體的S248-S9 區間控制穗長、單株鮮質量和單株干質量。3 號染色體的S250-S11 區間、8 號染色體的TXP354-RAD8-4 區間、10 號染色體的S79-TXP129 區間，均控制穗長和單株干質量。1 號染色體的GS57-TXP204 區間控制單株鮮質量和單株干質量。5 號染色體的S56-GS325 區間控制株高和穗長。6 號染色體的S236-TXP104 區間控制株高和單株鮮質量。

3 結論與討論

皖草3 號是由母本高粱不育系Tx623A 和父本恢復系蘇丹草Sa 雜交而成，它既有高粱抗旱、耐澇、耐鹽堿和產量高的特征，又有蘇丹草適口性好、抗逆性強、分蘗能力強、營養價值高的特點[19]。皖草3 號根系發達，莖稈粗壯，穗形松散，草質柔軟，氰化物含量低，單株長勢強，適應范圍廣，是通過全國牧草品種審定委員會審定的品種[15]，在農區養殖業發展中具有很好的應用前景[20]。

SSR 標記因其數量豐富，提供信息量大等優點，廣泛應用于遺傳圖譜構建與目標基因定位等研究中[18，21-23]。利用SSR 標記構建高粱遺傳圖譜及QTL定位已有成功應用，董維等[24]利用T70×P607 雜交F6的RIL 群體和81 對SSR 標記構建了遺傳連鎖圖譜，并在第1、2、4、5、6 號染色體上檢測到7 個與分蘗數相關的QTL。王成等[25]利用63 對SSR 標記和TAM428×Tx622B 的220 個F2單株構建了高粱抗蚜性狀的遺傳連鎖圖，并發現了1 個主效QTL。盧峰等[26]利用98 個SSR 標記和28 個INDEL 標記，定位了19 個與甜高粱莖汁混合錘度、莖稈質量和出汁率性狀的相關QTL。但高丹草作為一種優質、高產、抗逆性強的牧草，利用SSR 標記進行高丹草遺傳圖譜構建和QTL 定位的相關研究很少，于肖夏等[13]利用50 對SSR 引物建立了包含10 個連鎖群，總長度為803.13 cM的高丹草遺傳連鎖圖；石悅等[27]利用10 對SSR 引物和11 對SRAP 引物構建了包括10 個連鎖群，總長度為1 273.4 cM的遺傳連鎖圖。本研究利用138 對SSR 引物對Tx623A、Sa雜交的F9126 個RIL 群體構建的高丹草遺傳連鎖圖譜包含10 個連鎖群，總長度為1 606.7 cM，標記間平均距離為11.6 cM的高丹草遺傳圖譜，共定位了60 個與株高、莖粗、穗長、分蘗數、單株鮮質量和單株干質量相關的QTL。

其中控制株高的QTL 主要分布于4、5、6 號染色體上，與于肖夏等[13]和LU 等[14]定位的株高QTL相比，本研究定位的5、6 號染色體上的3 個位點均為新位點，其表型貢獻率均較高（分別為24.75%、27.02%和27.76%），可能為該性狀的主效位點。本研究中控制分蘗數的QTL 位于5 號染色體上，與于肖夏等[13]研究結果一致。穗長QTL 在10 條染色體均有分布，其中1 號染色體位于GS53-GS93 區間的QTL 位點貢獻率達68.58%，說明該位點為該性狀的主效位點，可進一步進行驗證和功能研究。單株鮮質量和干質量QTL 在除4 號染色體的9 條染色體上均有分布，而LU 等[14]只在1、3、6、7、9 號染色體上檢測到相關QTL 12 個。莖粗性狀可能由于標記數量較少或標記分布不夠均勻，QTL 定位并沒有關聯到相關位點，在后續研究中將加大標記密度或根據參考基因組設計新的引物再次定位。本研究中5 號染色體的S15-S56 區間為多效性位點，同時控制株高、穗長、分蘗數、單株干質量和單株鮮質量5 個性狀。在1、3、8、10 號染色體上也存在多效性位點，這可能是“一因多效”或多個基因間緊密連鎖造成的[28]。本研究中60 個QTL 位點只有3 個是正向加性效應，說明RIL 群體的這6 個農藝性狀的雜種優勢主要來自于父本Sa。

本研究構建了“高粱×蘇丹草”SSR 分子遺傳圖譜，總長度為1 606.7 cM，包含10 個連鎖群，標記間平均距離為11.6 cM。對株高、莖粗、穗長、分蘗數、單株鮮質量和單株干質量性狀進行QTL 定位分析；共定位了60 個QTL 位點，控制株高的4 個QTL，對表型的貢獻率為24.75%～33.59%，控制穗長的27 個QTL 對表型的貢獻率為14.05%～68.58%，控制分蘗數的1 個QTL 對表型的貢獻率為30.39%，控制單株鮮重的13 個QTL 對表型的貢獻率為17.69%～36.40%，控制單株干重的15 個QTL 對表型的貢獻率為20.32%～30.48%，旨在為分子標記輔助高丹草高產育種奠定基礎。