甘薯IbWRKY44 的克隆與表達分析

趙彩良，常 璐，呂運韜，張 潔，董靜靜，劉世芳，賈小云

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷 030801；2.山西農業大學農學院，山西太谷 030801；3.臨沂市河東區湯泉高級中學，山東臨沂 276027）

甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam）塊根富含多種營養成分如維生素、蛋白質以及花青素、類胡蘿卜素等，是重要的糧食作物。甘薯的種植具有操作簡單、成本低、產量高等特點，其產量僅次于水稻、小麥和玉米[1]。

花青素屬于類黃酮物質，是一種水溶性的可食用色素，存在于植物液泡中且在不同pH 條件下呈現粉色、紅色、藍色、紫色等顏色[2]。花青素不僅可以幫助植物抵抗不良的外界環境、吸引昆蟲傳播花粉，還在人類的醫療保健方面發揮著重要作用，如具有抗氧化、抗癌、預防心血管疾病等功能[3-5]。花青素的生物合成受到多種因素的調節，包括結構基因、調節基因、環境因子（光照、溫度、糖、激素、pH、干旱、肥料、病害等）以及microRNA 等。結構基因是指編碼花青素生物合成途徑中的酶基因，包括CHS（查爾酮合成酶）、CHI（查爾酮異構酶）、F3H（黃烷酮-3-羥化酶）、DFR（二羥基黃酮醇還原酶）、ANS（花色素合成酶）和UFGT（類黃酮糖基轉移酶）等。調節基因主要包括MYB、bHLH 和WD40 三類轉錄因子，它們通過形成MBW 復合體來參與調控花青素的生物合成。近年來也發現許多其他類型的轉錄因子參與了花青素生物合成的調控，包括NAC、WRKY、AP2、SPL等。楊慧珍[6]研究表明，IbANS 在紫色甘薯的塊根、莖和葉中的表達量均顯著高于白色甘薯，可能參與花青素的合成。CHU 等[7]研究表明，過表達IbMYB1 的轉基因擬南芥中花青素的含量上升且花青素合成相關基因CHI、F3′H、DFR 的表達量均上調。DONG等[8]的研究發現，甘薯IbWD40 的表達量隨花青素的積累而升高。目前有關甘薯花青素的研究主要集中在MBW 復合體的調控機制上，而關于甘薯WRKY 轉錄因子對花青素調控的研究鮮有報道。

WRKY 轉錄因子的N 端含有保守基序為WRKYGQK 的WRKY 保守結構域，C 端含有C2H2或C2HC 鋅指結構[9-10]。WRKY 轉錄因子一般通過與基因啟動子中的W-Box 作用元件特異結合而調控基因的轉錄，進而調控植物的生長發育過程[10]。根據結構域的數量和特征，WRKY 轉錄因子可分為GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ等3 類，Group I 有2 個結構域，鋅指結構為C2H2；GroupⅡ和GroupⅢ均只有1 個結構域，鋅指結構分別為C2H2和C2HC。根據WRKY 結構域外的其他保守結構基序，GroupⅢ成員可進一步分為IIa、IIb、IIc、IId 和IIe 等5 個亞類[9]。WRKY 轉錄因子在植物的生長發育、新陳代謝、脅迫響應及次生代謝中具有重要作用。擬南芥AtWRKY44 在毛狀體形成、花青素積累、種子色素沉著、胚乳發育、種子大小和根部有無毛細胞分化等生長發育進程中均發揮作用[11-15]。HAN 等[16]研究發現，在干旱脅迫下，GI-miRNA172E-AtWRKY44調控擬南芥的糖信號通路從而加速植株開花。王熙然[17]在草莓中過表達FaWRKY44 后，果實中花青素含量顯著上升，原花青素含量下降；而減低表達FaWRKY44 后，花青素含量顯著下降，原花青素含量顯著上升。CHENG 等[18]在紅火龍果中研究發現，HpWRKY44 通過與HpCytP450-like1 啟動子中的W-Box 元件結合而激活其表達，二者在果實著色過程中含量逐步增加。楊樹等[19]研究發現，丹參SmTTG2（SmWRKY44）的表達量隨著花和種子的發育逐漸升高，推測其參與丹參種子的發育及萌發過程。PENG等[20]研究發現，獼猴桃的AcWRKY44 和AcMYBC1在煙草葉片中瞬時過表達會促進煙草葉片積累花青素，但在獼猴桃愈傷組織中穩定過表達后會促使F3′5′H 和原花青素合成相關基因及原花青素含量升高，說明AcWRKY44 和AcMYBC1 在平衡花青素與原花青素的含量方面具有重要作用。煙草NtTTG2 通過調控NtARF8、NtARF17 和NtARF19進而影響煙草的生長發育[21]。目前尚未見到關于甘薯IbWRKY44 功能研究的相關報道。紫心甘薯塊根富含花青素，是研究植物地下器官中花青素生物合成調控機制的理想材料。

本研究從紫心甘薯塊根中克隆了IbWRKY44，通過生物信息學分析和表達特性分析，初步探究了IbWRKY44 在花青素生物合成中的作用，并且成功構建了融合表達載體，為深入解析甘薯IbWRKY44在甘薯塊根中花青素合成調控機制的研究提供參考依據，對培育富含花青素的甘薯新品種具有重要的理論和指導意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試紫心甘薯有徐紫薯3 號（XZS-3）、徐紫薯8 號（XZS-8）和寧紫薯4 號（NZS-4），白心甘薯有徐薯18 號（XS-18）和薯綠1 號（SL-1），淡黃心品種高系14（GX-14），均由江蘇省農業科學院徐州甘薯研究中心提供，種植于山西農業大學甘薯基地。本氏煙草（Nicotiana benthamiana Domin.）和Columbia型野生擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子由山西農業大學生命科學學院分子生物學實驗室保存，擬南芥T-DNA 插入突變體種子（SALK-206852C 和SALK-204777C）購自AraShare 網站（www.arashare.cn）。煙草和擬南芥植株種植于人工氣候培養箱，培養條件為溫度26 ℃，光照16 h（光照強度125 mmol/（m2·s）），黑暗8 h，濕度50%。

大腸桿菌菌株DH5α 和農桿菌菌株GV3101均由山西農業大學生命科學學院分子生物學實驗室保存。

1.2 RNA 的提取與cDNA 的合成

取種植90 d 的XZS-3、XZS-8、NZS-4、XS-18、SL-1 和GX-14 的塊根，液氮研磨后用RNAiso Plus試劑提取RNA，經瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白檢測儀NanoDrop 2000C（Thermo Scientifc）檢測RNA 的完整性和質量后，按照TAKARA 反轉錄試劑盒的說明書反轉錄生成cDNA。

1.3 IbWRKY44 基因的克隆

通過分析山西農業大學生命科學學院賈小云課題組白心甘薯和紫心甘薯塊根的轉錄組數據，找到在紫心甘薯中高表達而在白心甘薯中低表達的序列（Tai6.25536.1），經序列同源性比對，與擬南芥AtWRKY44 的相似性最高，命名為IbWRKY44。設計含有KpnⅠ（GGTAC|C）和SalⅠ（G|TCGAC）酶切位點的克隆引物（IbWRKY44-PF-KpnⅠ：GGGGTACC TTGAAGATGGAGATCAAAGAG；IbWRKY44-PRSalⅠ：GCGTCGACCCATCTCGGTTTTTGTCTG-AT），以XZS-3 塊根的cDNA 為模板進行PCR 擴增，擴增產物純化回收后與克隆載體PMD19-T 相連，獲得重組質粒PMD19-T-IbWRKY44，將其轉入大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素（Amp）的固體培養基上挑選克隆進行PCR 鑒定，提取陽性克隆的質粒DNA后送上海生物工程有限公司（中國，上海）測序。

1.4 IbWRKY44 的生物信息學分析

通過在線軟件對IbWRKY44的氨基酸序列進行生物信息學分析，所用網址如表1 所示。

表1 IbWRKY44 序列分析所用網址及功能

1.5 IbWRKY44 的系統進化分析

下載PlantTFDB 中注釋明確的擬南芥的69 個WRKY 家族成員的氨基酸序列，與IbWRKY44 的氨基酸序列利用MEGA 軟件構建系統進化樹。同時，將NCBI 中與IbWRKY44 氨基酸序列相似度較高的牽牛花、番茄、大豆等12 個物種的WRKYs 序列和IbWRKY44 利用DNAMAN 和MEGA 軟件分別進行多序列比對和系統進化樹的構建。

1.6 IbWRKY44 啟動子的順式作用元件分析

在甘薯基因組數據庫（https://ipomoea-genome.org/）中比對獲得IbWRKY44 基因的DNA 序列。下載IbWRKY44 基因起始密碼子ATG 上游1 600 bp的序列，通過PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html）進行啟動子順式作用元件分析。

1.7 IbWRKY44 的表達模式分析

根據IbWRKY44 的序列設計定量引物：qRTPCR-IbWRKY44-PF：CACCGTGCTATCCCGTTACA；qRT-PCR-IbWRKY44-PR：GCCTTCTGCCTCCAAT CCTT。以XZS-3、XZS-8、NZ-4、XS-18、SL-1 和GX-14 塊根的cDNA 為模板，運用BIO-RAD CFX 96 熒光定量儀對IbWRKY44 基因進行表達模式分析，IbActin 為內參基因，每個樣品設置3 個生物學重復。基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法，運用SPSS Statistics v23 軟件對數據進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

1.8 IbWRKY44 融合表達載體的構建

將測序得到的IbWRKY44 序列去除終止密碼子后設計帶有SalⅠ酶切位點的后引物IbWRKY44-2PR-Sal Ⅰ：GCGTCGACTGATTTTTCCTTTGTGGC。以PMD19-T-IbWRKY44 質粒DNA 為模板進行PCR 擴增，對擴增產物和pCAMBIA1300-GFP 表達載體分別用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切，回收目的片段，T4 DNA 連接酶連接后轉至大腸桿菌DH5α，挑選在添加卡那霉素（Kan）的LB 固體培養基上生長的克隆進行PCR 鑒定。提取陽性克隆的質粒DNA，用KpnⅠ和SalⅠ對質粒進行雙酶切驗證，獲得35S：：IbWRKY44：：GFP 融合表達載體，4 ℃保存待用。

1.9 IbWRKY44 的煙草亞細胞定位

將空載體pCAMBIA1300-GFP 和構建好的35S：：IbWRKY44：：GFP 融合表達載體分別通過熱激法轉入農桿菌菌株GV3101 中，挑取在含有50 μg/mLKan 和50 μg/mL 利福平（Rif）的固體LB培養基上的克隆，經PCR 鑒定為陽性克隆后（35SF：GACGCACAATCCCACTATCC 和 IbWRKY44-2PR-SalⅠ），于50 mL 相應液體培養基中過夜培養至OD600為0.6，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，棄上清收集菌體，用含有10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES）和100 μmol/L 乙酰丁香酮（AS）的懸浮液重懸菌體至OD600為0.2，室溫孵育4 h 后注射長勢一致的28 d 煙草葉片，培養箱培養2～3 d后撕取注射部位葉片，經1 μg/mL 的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色5 min 后在Leica 熒光正置顯微鏡488 nm 的波長下觀察綠色熒光。亞細胞定位的預測根據表1 所列網址進行。

2 結果與分析

2.1 IbWRKY44 基因的克隆

以XZS-3 塊根cDNA 為模板獲得的PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后條帶單一，大小約為1 400 bp，純化回收后與PMD19-T 克隆載體連接，得到的菌落PCR 檢測條帶也單一，且大小一致，約1 400 bp（圖1）。陽性菌落提取的質粒DNA 經測序后，得到長度為1 401 bp 的IbWRKY44 基因的ORF序列。

2.2 IbWRKY44 序列的生物信息學分析

SMART 網站對保守結構域的分析顯示，Ib-WRKY44 的氨基酸序列中含有2 個WRKY 保守結構域和2 個C2H2的鋅指結構，共466 個氨基酸（圖2）。ProtParam 分析顯示，IbWRKY44 蛋白的預測分子質量為51 083.08 u，分子式為C2192H3518N654O717S18，總原子數為7099，等電點為9.31，脂溶性指數為53.99，不穩定系數為47.63，表明IbWRKY44 蛋白為堿性不穩定蛋白。NetPhos 分析顯示，IbWRKY44存在67 個磷酸化修飾位點，其中，絲氨酸磷酸化位點有40 個，蘇氨酸磷酸化位點有23 個，酪氨酸磷酸化位點有4 個（圖3-A）。NetNGlyc 分析表明，IbWRKY44 在第36、64、266 個氨基酸位點的天冬酰胺可能存在3 個糖基化位點（圖3-B）。ProtScale分析結果表明，IbWRKY44蛋白的氨基酸分值介于-2.822～1.511 之間，且疏水區域的面積明顯大于親水區域，表明IbWRKY44蛋白為疏水性蛋白（圖3-C）。信號肽分析結果顯示，IbWRKY44蛋白沒有信號肽。TMHMM 分析結果表明，IbWRKY44 蛋白沒有跨膜結構域（圖3-D）。Wolf Psort Prediction 結果顯示，IbWRKY44定位于細胞核內。二級結構預測顯示，IbWRKY44蛋白主要由α-螺旋（15.24%）、β折疊（3.65%）、無規則卷曲（70.39%）和延伸鏈（10.73%）組成（圖3-E）。三級結構預測發現，該蛋白具有典型的WRKY 轉錄因子的4β 折疊結構（圖3-F）。

2.3 IbWRKY44 的系統進化分析與多序列比對

采用鄰接法構建IbWRKY44 與69 個擬南芥WRKYs 蛋白的進化樹，結果顯示（圖4），Ib-WRKY44 與擬南芥AtWRKY44 聚為一支。利用DNAMAN 軟件對IbWRKY44 與12 個物種的WRKY44 氨基酸序列進行多序列比對，結果顯示，序列相似度為61.38%，均含有2 個WRKY 結構域，且鋅指結構為C2H2（圖5）；物種間系統進化關系顯示，IbWRKY44 與同為旋花科的甘薯二倍體ItWRKY44 和牽牛InWRKY44 親緣關系最近，與葡萄VvWRKY44 親緣關系最遠（圖6）。

2.4 IbWRKY44 啟動子的順式作用元件分析

通過在線軟件PlantCARE 分析IbWRKY44 上游1 600 bp 啟動子序列的順式作用元件，結果顯示，序列中除含有TATA-box 和CAAT-box 等啟動子基礎元件外，還含有G-Box、GT1-motif、MRE 等光響應元件，脫落酸響應元件ABRE，乙烯響應元件ERE 等元件，以及MYC、MYB、AP1 等轉錄因子的結合位點（表2）。

表2 IbWRKY44 啟動子的順式作用元件分析

2.5 IbWRKY44 的表達特性分析

IbWRKY44 在3 個紫心甘薯XZS-3、XZS-8 和NZS-4 和3 個非紫心甘薯XS-18、SL-1 和GX-14的塊根中的表達量有顯著差異。從圖7 可以看出，IbWRKY44 在不同甘薯品種中均表達，但在紫心甘薯中的表達量顯著高于非紫心甘薯，與轉錄組數據一致。

2.6 IbWRKY44 表達載體的構建

以PMD19-T-IbWRKY44 質粒DNA 為模板的擴增產物和pCAMBIA1300-GFP 表達載體經KpnⅠ和SalⅠ雙酶切，連接后轉至大腸桿菌DH5α，提取陽性克隆的質粒DNA，用KpnⅠ和SalⅠ對質粒進行雙酶切驗證（圖8），酶切獲得2 條預期條帶，一條為pCAMBIA1300-GFP 載體片段，另一條目的條帶與IbWRKY44 基因的PCR 產物大小一致，表明Ib－WRKY44 序列已連接到pCAMBIA1300-GFP 過表達載體，命名為35S：：IbWRKY44：：GFP 融合表達載體。

2.7 IbWRKY44 的亞細胞定位

亞細胞定位的預測結果顯示，IbWRKY44 基因位于細胞核。為驗證這一結果，本研究注射煙草葉片進行瞬時表達，觀察GFP 熒光部位。將DAPI 染色后的煙草葉片撕取表皮細胞，在488 nm 波長下觀察綠色熒光。由圖9 可知，轉化空載（pCAMBIA1300-GFP）的葉片細胞在細胞質、細胞質膜及細胞核中都存在綠色熒光，而轉化融合表達載體（35S：：IbWRKY44：：GFP）的葉片表皮細胞只在細胞核中有綠色熒光，表明IbWRKY44 蛋白定位于細胞核內，與預測結果一致。

3 結論與討論

WRKY 轉錄因子參與植物花青素及其他次生代謝物的合成，大麥HvWRKY23 可以與花青素合成通路基因HvPAL2、HvCHS1 的啟動子結合進而促進花青素的合成[22]。YU 等[23]研究發現，丹參中SmWRKY1、SmWRKY7、SmWRKY19、SmWRKY29、SmWRKY45、SmWRKY52、SmWRKY56、SmWRKY58和SmWRKY68 可能參與酮和酚酸的合成。同時，WRKY 轉錄因子在脅迫響應方面也發揮著重要作用，WEI 等[24]研究發現，GmWRKY54 通過激活轉基因大豆ABA 和Ca2+信號通路的基因從而提高植物的抗旱性。張鵬飛[25]在棉花中發現，枯萎病原菌和SA、ETH、JA 等激素的誘導能夠激活GhWRKY75基因的表達，進而調控植物對枯萎病的抗性。趙曾強等[26]研究發現，過表達GhWRKY44 的煙草在枯萎病菌的侵染下能夠激活抗病相關基因的表達。此外，大量的研究還表明，WRKY 轉錄因子參與調控植物的生長發育和衰老進程。ZHENG 等[27]在蘋果中發現，MdWRKY9 通過抑制油菜素類固醇MdDWF4的轉錄，從而減少矮化調控因子油菜素類固醇的產生。擬南芥AtWRKY75 通過抑制下游基因的表達來調控根毛的發育[28]。

本試驗從XZS-3 的塊根中克隆到IbWRKY44，其ORF 序列長度為1 401 bp，編碼的蛋白屬于GroupⅠ家族，鋅指結構為C2H2，含有2 個WRKY結構域。IbWRKY44序列中含有67 個磷酸化位點和3 個糖基化位點，表明IbWRKY44 蛋白可能在蛋白激酶或糖基化作用的調控下，在信號轉導、細胞周期等方面發揮作用。本試驗預測的IbWRKY44蛋白的三級結構中包括4 個β 折疊，與WRKY 轉錄因子的空間結構相符。IbWRKY44的煙草亞細胞定位表明，該基因編碼的蛋白位于細胞核，在細胞核內發揮功能。IbWRKY44與擬南芥WRKY 家族的AtWRKY44 親緣關系最近，在物種間的進化關系上與同屬旋花科的甘薯二倍體三葉裂薯ItWRKY44和牽牛InWRKY44 的親緣關系最近，表明IbWRKY44可能具有與AtWRKY44、ItWRKY44 和InWRKY44相似的功能。多序列比對結果表明，IbWRKY44與其他物種的WRKY44 均含有2 個WRKY 結構域，屬于Ⅰ類轉錄因子。

IbWRKY44 的啟動子序列中包含脫落酸、乙烯、厭氧和光響應誘導元件，表明脫落酸、乙烯、厭氧和光誘導響應機制中的相關因子可被IbWRKY44 的啟動子激活或抑制轉錄調控過程，從而在植物的生長發育或在對環境的適應機制中發揮作用；包含調節胚乳發育的元件，推測IbWRKY44 參與調控植物胚乳的發育，且調控機制可能與擬南芥AtWRKY44 類似；還含有AP1、MYB 和MYC 轉錄因子的結合位點，說明IbWRKY44 還可能受AP1、MYB 和MYC 轉錄因子的調控。

基因表達特性分析結果顯示，IbWRKY44 在紫心甘薯塊根中的表達量顯著高于非紫心甘薯，表明IbWRKY44 可能正調控甘薯塊根中花青素的合成。該結果為解析甘薯IbWRKY44 的功能提供了理論基礎，豐富了甘薯花青素合成的潛在調節網絡，同時為紫心甘薯的分子育種提供了新的研究思路。為了深入研究IbWRKY44 在花青素合成中的功能及挖掘其他功能，后期將對構建好的35S：：IbWRKY44：：GFP 過表達載體進行擬南芥的轉化，篩選得到T3純合且IbWRKY44 高表達的植株，并測定轉基因植株中花青素的含量與花青素合成相關基因的表達量；構建CRISPR-IbWRKY44 敲除表達載體，將其與35S：：IbWRKY44：：GFP 過表達載體分別進行甘薯懸浮細胞的轉化，對得到的轉基因甘薯苗進行基因層面的鑒定及表型觀察，移至試驗田中獲得薯塊，對薯塊進行表型觀察及測序分析。同時，篩選與IbWRKY44互作的蛋白，研究其作用機制。