發酵麥麩多糖對氧化應激大鼠脾臟的保護作用研究

王 勤，王文文，王 園, ，段元霄，安曉萍，齊景偉

（1.內蒙古自治區藥品檢驗研究院，內蒙古呼和浩特 010010；2.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區草食家畜飼料工程技術研究中心，內蒙古呼和浩特 010018）

氧化應激是指機體在受到刺激時，活性氧和活性氮產生量大于清除量，氧化系統和抗氧化系統失衡，導致其在體內大量積累引發氧化損傷的過程[1]。如果這種氧化損傷不能及時修復就會誘導其他疾病的發生。研究發現，氧化應激易引發自身免疫疾病，如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎和Ⅰ型糖尿病等[2]。脾臟作為外周免疫器官，含有大量的淋巴細胞和其他免疫細胞，具有儲血、濾血、內分泌調節以及免疫應答等功能。免疫細胞因細胞膜中含有不飽和脂肪酸，所以對氧化應激十分敏感，在受到自由基攻擊后，會影響免疫功能[3]。因此，通過使用抗氧化劑緩解脾臟氧化應激，改善機體健康狀況意義重大。

多糖是一類從天然植物中提取的生物活性物質，具有抗氧化、調節免疫、抑菌及抗腫瘤等作用[4]。小麥麩皮中約含有46%左右的非淀粉多糖（果膠多糖、纖維素多糖及非纖維素多糖），且含有一定量的酚酸類物質[5]。多項研究表明，小麥麩皮經過微生物發酵處理會增加生物活性物質的含量，進而提高其抗氧化能力[6-7]。Zhang等[8]研究發現麥麩阿魏酰低聚糖可以緩解由AAPH誘導的氧化應激，提高氧化應激大鼠心臟、肝臟和腎臟組織中過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性以及谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量。然而，關于發酵麥麩多糖（Fermentedwheat bran polysaccharides，FWBPs）在緩解脾臟氧化應激方面的報道還不多見。因此，本試驗通過體外抗氧化指標評價FWBPs的抗氧化活性，并進一步以腹腔注射敵草快（Diquat）建立大鼠氧化應激模型，研究FWBPs對氧化應激大鼠脾臟的保護作用，以期為FWBPs應用于抗氧化方面保健產品的開發利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性SD大鼠 48只，20～22日齡，體重40～50 g，由內蒙古醫科大學試驗動物中心提供，合格證號SCXK（蒙）2015-0001，大鼠每天給予充足的水和飼料，3 d后開始試驗；麥麩、豆粕粉、玉米粉 市場；DPPH（二苯基-2-三硝基苯肼）、丁基羥基茴香醚（BHA）、維生素 C（VC） 美國 Sigma公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 2.119、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CGMCC 1.0892 內蒙古自治區草食家畜飼料工程技術研究中心保存；無水乙醇、六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸 國藥集團化學試劑有限公司；氯仿（分析純）、異丙醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總抗氧化能力（Total antioxitant capacity，TAOC）、SOD、CAT測試盒 南京建成生物工程研究所；GSH-Px、GSH和 8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy deoxyguanosine，8-OHdG）試劑盒 武漢基因美生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；Invitrogen TRIzol試劑 美國賽默飛世爾科技公司；FastQant RT Kit（with gDNase）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒 北京天根生化試劑有限公司；大鼠基礎飼糧 江蘇協同醫藥生物工程有限公司。

HVA-85型壓力滅菌器 日本Hirayama公司；SW-CJ 超凈工作臺 上海新苗醫療器械；QYC-200恒溫培養搖床 上海福瑪實驗設備有限公司；LRH-250F生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；TDL-5-A型臺式高速離心機 上海安亭科學儀器廠；Epoch2 型微孔板分光光度計 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 FWBPs的制備 試驗所用FWBPs制備方法參照李暄[9]。先將麥麩、豆粕和玉米粉碎，過40目篩，以麥麩、豆粕粉和玉米粉（質量比=80.46:9.32:10.22）為基質，按照10%接種量接入以混合種子液，混合種子液由比例為釀酒酵母和枯草芽孢桿菌6.7:3.3 組成，料水比 1:1，35.4 °C 發酵 48 h。發酵結束后，將發酵基質于45 °C烘干48 h，粉碎后與蒸餾水1∶20混合，80 °C水浴浸提30 min，上清液加入4倍體積的95%乙醇溶液，靜置過夜，離心收集沉淀，經過酶處理與Sevag法相結合法去除蛋白質后，獲得FWBPs，多糖含量為633.58 mg/g，該多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成，摩爾比為5:4:46:9:67:46。

1.2.2 FWBPs體外抗氧化活性評價

1.2.2.1 還原力的測定 還原力的測定方法參照Jia等[10]， 分別取不同濃度（0、0.5、1、2、4 mg/mL）的FWBPs溶液0.75 mL，依次各加入0.75 mL的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）及0.75 mL的六氰合鐵酸鉀溶液（1%），混勻，50 ℃ 水浴 20 min，冷卻，再加入0.75 mL的10%三氯乙酸終止反應，3000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液，加入1.5 mL蒸餾水和 400 μL 0.1% 三氯化鐵，室溫反應 10 min，700 nm處測定吸光度值A1，空白對照以蒸餾水代替FWBPs溶液測得吸光度值A0，還原力=A1-A0。以BHA作為陽性對照，測定方法同上。

1.2.2.2 DPPH自由基清除率的測定 DPPH自由基清除率的測定參照Zhang等[11]方法，取2 mL不同濃度（0、0.5、1、2、4 mg/mL）的 FWBPs溶液和 2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L，95%乙醇溶液）混勻，室溫黑暗條件下反應30 min，517 nm測定吸光度值A。以BHA作為陽性對照，測定方法同上。計算公式：

式中：A0：樣品吸光度；A1：乙醇代替DPPH溶液吸光度；A2：蒸餾水代替樣品吸光度。

1.2.2.3 羥基自由基清除率的測定 羥基自由基清除率的測定參照Zhang等[11]的方法，取0.5 mL濃度為（0、0.5、1、2、4 mg/mL）的 FWBPs與 0.5 mL硫酸亞鐵溶液（9.0 mmol/L）和 0.5 mL雙氧水溶液（8.8 mmol/L）混合，室溫反應10 min，再加入0.5 mL水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L），室溫反應 30 min，510 nm測定得吸光度A。以BHA作為陽性對照，測定方法同上。計算公式：

式中：A0：樣品吸光度；A1：蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液吸光度；A2：蒸餾水代替樣品吸光度。

1.2.3 FWBPs對氧化應激大鼠脾臟保護作用評價

1.2.3.1 動物分組及造模給藥處理 將48只健康斷奶雄性Wistar大鼠隨機分為6個組，每組8只，動物分組及造模給藥處理如表1。FWBPs（低、中、高）組和陽性對照組大鼠持續灌胃14 d，每日1次，正常對照組和氧化應激模型組大鼠灌胃給予等量的生理鹽水。最后一次灌胃2 h后，除正常對照組外，其它五組腹腔注射敵草快（0.1 mmol/kg BW）建立氧化應激模型。24 h后，乙醚致暈，剖開腹腔，收集脾臟組織，液氮速凍，存于-80 ℃冰箱中待測。試驗在內蒙古農業大學動物科學學院進行，常規飼養管理，自由采食、飲水。

表1 試驗動物分組設計Table 1 Experimental design and animal grouping

1.2.3.2 抗氧化相關指標的測定 取適量脾臟組織，加磷酸緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4）制備 10%（w/w）組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液用于總蛋白、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px、GSH和 8-OHdG的測定，所有操作均按試劑盒說明書進行。

1.2.3.3 抗氧化相關基因表達水平分析 采用Trizol法提取大鼠脾臟組織總RNA。經微孔板分光光度計測得A260nm和A280nm比值在1.8～2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳法評價RNA質量。參照FastQant RT Kit（with gDNase）說明書分別將各樣品的總RNA進行逆轉錄合成cDNA，并以此為模板，使用表2所列的引物，按照 SuperRealPreMix Plus（SYBR Green）說明書進行Real-time PCR檢測。以β-肌動蛋白（βactin）為內參，谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（Glutamate cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶調節亞基（Glutamate cysteine ligase modifiersubunit，GCLM）、醌氧化還原酶 1（NAD（P）Hquinoneoxidoreductase 1，NQO1）、血紅素氧合酶（heme oxygenase-1，HO-1）及核因子E2相關因子 2（Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。引物由上海生工生物有限公司合成，詳細信息見表2。

表2 抗氧化基因的引物序列Table 2 Primer sequences of antioxidant genes

1.3 數據處理

試驗數據采用SAS 9.2進行統計分析，其中正常對照組和氧化應激組進行t檢驗，低、中、高劑量組與陽性對照組進行單因素方差分析，并用Duncan’s檢驗進行多重比較。試驗結果均以平均值和標準差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 FWBPs體外抗氧化活性

2.1.1 還原力 還原力是評價抗氧化能力的一個重要指標[12]，還原力越強，表明其抗氧化能力越高。由圖1所示，隨著FWBPs溶液濃度的增加，其還原力也逐漸增加；當FWBPs溶液濃度達到4 mg/mL時，其還原力顯著提高（P＜0.05），但仍顯著低于陽性對照BHA（P＜0.05）。與上述研究結果相似，杜涓等[13]研究結果顯示，當樣品濃度達到4 mg/mL時，四種不同組分的 FWBPs（吸光值分別為 0.24、0.58、0.67、0.61）的還原力增加，但不如BHA的還原力強。FWBPs是一種混合物，其中含有的低聚糖基團和阿魏酰基團可能會影響氧化還原電位，影響其還原力[14]。由此推測，FWBPs的抗氧化作用可能是由于其含有低聚糖和酚酸類物質。研究發現，低聚糖在抗氧化方面有良好作用[15]，而阿魏酸是一種公認的抗氧化劑，被廣泛應用于食品工業領域[16]。

2.1.2 DPPH自由基清除率 過量的DPPH自由基會破壞機體細胞結構，造成其功能障礙甚至死亡[17]。由圖1所示，當FWBPs濃度在 0.5～2 mg/mL范圍內時，DPPH自由基清除能力顯著提高（P＜0.05），4 mg/mL時DPPH自由基清除率最高，可達92.35%，且與陽性對照BHA的清除能力相當。此結果與杜涓等[13]研究結果相似，四種不同組分的FWBPs均有較強的DPPH自由基清除能力，4 mg/mL的清除率可達80%。此結果表明，FWBPs對DPPH自由基有較強的清除作用。

圖1 不同濃度FWBPs的體外抗氧化活性Fig.1 In vitro antioxidant activity of FWBPs with different concentrations

2.1.3 羥基自由基清除率 羥基自由基是一種極具危害的自由基，具有很強的氧化活性，可以直接損傷核酸、蛋白質、脂質等生物大分子，進而影響機體健康[12]。由圖1所知，當FWBPs濃度在0.5～2 mg/mL范圍內時，其羥基自由基清除率顯著高于同濃度的陽性對照 BHA（P＜0.05）；當濃度在 4 mg/mL 時，BHA的羥基自由基清除率與FWBPs相當。與上述結果相似，呂青青[18]研究發現，小麥麩皮多糖有較強羥基自由基清除能力，可達30%。

2.2 FWBPs對氧化應激大鼠脾臟保護作用

2.2.1 FWBPs對氧化應激大鼠脾臟抗氧化相關指標的影響 動物機體可以通過抗氧化體系來清除過量自由基，進而緩解氧化應激。抗氧化體系包括由GSH-Px、CAT及SOD等抗氧化酶組成的酶體系和由GSH、維生素C、維生素E、類胡蘿卜素、類黃酮、膽紅素及微量元素硒等物質組成的非酶體系[19-21]。8-OHdG是一種有害氧化代謝產物，是目前研究公認的評價氧化應激損傷的指標[22]。如表3所示，敵草快攻毒會導致大鼠脾臟GSH-Px活性顯著下降（P＜0.05），T-AOC和 8-OHdG的含量顯著增加（P＜0.05），這說明敵草快攻毒導致抗氧化酶活性降低，而氧化代謝產物8-OHdG含量增加，大鼠脾臟氧化應激模型構建成功。有趣的是，敵草快攻毒提高了T-AOC，這可能與攻毒條件下抗氧化體系被激活有關，具體原因有待進一步研究。與氧化應激模型組相比，低和中劑量組中GSH-Px活性顯著增加（P＜0.05）；低劑量組中 GSH 含量顯著增加（P＜0.05）；而中、高劑量組和陽性對照組中8-OHdG的含量顯著降低（P＜0.05）。多項研究發現，FWBPs可提高大鼠組織中SOD、CAT及GSH-Px等抗氧化酶的活力及mRNA表達水平[23-24]。與本試驗結果相似，殼聚糖可通過增加敵草快攻毒仔豬血清中GSH-Px、CAT及SOD的活性，進而緩解氧化應激[25]。此結果表明，FWBPs可通過增加GSH-Px活力、GSH含量，降低8-OHdG的含量緩解敵草快攻毒所致的脾臟氧化應激。

表3 FWBPs對氧化應激大鼠脾臟抗氧化相關指標的影響Table 3 Effects of FWBPs supplementation on antioxidant indices in spleen of oxidative stress rats

2.2.2 FWBPs對氧化應激大鼠脾臟抗氧化相關基因表達的影響 為了進一步探討FWBPs對大鼠脾臟氧化應激緩解作用的可能分子機制，本試驗測定了脾臟抗氧化相關基因的相對表達量。由表4所示，敵草快攻毒會導致大鼠脾臟GCLM的mRNA表達水平顯著增加（P＜0.05）。與氧化應激模型組相比，中劑量組大鼠脾臟中NQO1和Nrf2的mRNA表達量顯著增加（P＜0.05）。核因子 E2 相關因子 2（Nrf2）信號通路是目前研究發現的最經典的內源性抗氧化應激通路之一[26]。在氧化應激發生后，Nrf2會被活化，與kelch樣ECH相關蛋白1（kelchlike ECH associated protein1，Keap1）解離，進入細胞核與抗氧化反應元件（Antioxidant response element，ARE）結合，促進HO-1、NQO1、GCLC和 GCLM的轉錄和表達，誘導CAT、SOD和GSH-Px等抗氧化酶的轉錄和表達，進而緩解氧化應激[27]。HO-1可通過與金屬離子螯合、修飾蛋白巰基及清除自由基等方式防御氧化應激[28]。醌類可被NQO1直接被還原成氫醌，進而減少醌類轉化產生的氧自由基，從而緩解醌類物質代謝引起氧化應激損傷[29]。谷氨酸-半胱氨酸連接酶是由催化亞基GCLC和調節亞基GCLM組成的二聚體，它可以調控GSH的合成[30]。由此結果推測，FWBPs可通過激活Nrf2，增加NQO1的mRNA表達量，進而緩解敵草快攻毒所致的脾臟氧化應激。

3 討論與結論

研究發現，氧化應激與肥胖、糖尿病、帕金森病及心腦血管疾病等慢性疾病的發病機制密切相關[31]。一般通過攝食抗氧化類物質來提高機體抗氧化能力，緩解氧化應激。動物機體主要通過抗氧酶和抗氧化物質抵抗氧化應激。本試驗發現，氧化應激模型組大鼠脾臟GSH-Px活力下降，而FWBPs預處理可增加氧化應激大鼠脾臟GSH-Px活力、GSH含量及NQO1和Nrf2的mRNA表達量，并可降低8-OHdG的含量。由此推測，FWBPs的抗氧化作用可能是通過激活Nrf2，促進NQO1的轉錄和表達，誘導GSHPx的表達和GSH的分泌，進而緩解敵草快攻毒所致的脾臟氧化應激，保護脾臟健康。FWBPs的抗氧化作用機制可能是多途徑的，后續有待深入研究脾臟組織中抗氧化信號通路相關蛋白表達情況，以探明FWBPs的靶向作用機制。

體外試驗結果顯示，4 mg/kg BW FWBPs對DPPH自由基和羥基自由基都有較強的清除作用，且與陽性對照BHA作用相當，這證明FWBPs有較強的體外抗氧化作用。體內試驗發現，FWBPs預處理可增加氧化應激大鼠脾臟GSH-Px活力、GSH含量及NQO1和Nrf2的mRNA表達量，并可降低8-OHdG的含量。綜上所述，FWBPs具有較好的體外、體內抗氧化能力及氧化應激修復作用，可作為一種天然抗氧化劑應用于食品工業領域，本試驗也為FWBPs的開發利用提供了理論參考。