大學生腸道陰溝腸桿菌與體質指數的相關性研究

羅春雨，李亞飛，劉 奇

（大理大學基礎醫學院，云南大理 671000）

腸道菌群與體脂沉積和肥胖的發生有著密切的聯系〔1〕，腸道菌群影響著人體的營養吸收、免疫功能及代謝作用〔2-3〕。陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）屬于腸桿菌科腸桿菌屬，為革蘭氏陰性粗短桿菌，是腸道正常菌種之一，也是重要的條件致病菌。趙立平等〔4〕在對腸道菌群的研究中發現，患者肥胖與腸道的陰溝腸桿菌有直接聯系。伊紅美藍培養基可以初步分離革蘭氏陰性腸道致病菌，在該選擇培養基上，大腸埃希菌呈現紫黑色金屬光澤菌落，產氣腸桿菌呈棕色的大菌落，沙門氏菌等為無色或琥珀色半透明菌落，陰溝腸桿菌為粉色大菌落，因此使用該選擇性培養基可對腸道桿菌作初步篩選。本研究采用Spearman 秩相關系數法，分析陰溝腸桿菌在腸桿菌科中的菌落數比例與在校學生體質指數（body mass index，BMI）的相關性，從而對陰溝腸桿菌與在校大學生肥胖的關系進行探究〔5〕，進一步為個體化的科學減肥方法提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 大理大學在校42 名健康大學生新鮮糞便0.5～3.0 g；陰溝腸桿菌標準菌株ATCC 700323，由大理大學病原生物學綜合實驗室提供，于－80 ℃冰箱保存。

1.1.2 試劑 伊紅美藍培養基、營養瓊脂培養基（青島高科園海博生物技術有限公司）；10×PCR Mix、100 bp DNA Marker（南京賽泓瑞生物科技有限公司）；Tris 飽和酚（宜興市廣匯助劑化工有限公司）；氯仿、異戊醇（上海邁瑞爾化學技術有限公司）；引物由蘇州金智唯生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 形態學檢測 將所得糞便標本分別進行涂片、革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。

1.2.2 標本的稀釋和培養 用無菌0.9%氯化鈉溶液以10 倍稀釋法稀釋0.1 g 新鮮糞便。用無菌棉簽將稀釋后的標本均勻涂布于伊紅美藍培養基上，37 ℃培養24 h。確定最佳稀釋梯度為10－3～10－4g/mL。再將該稀釋濃度的糞便樣品涂布于伊紅美藍培養基上，每份樣品重復3 次，37 ℃培養24 h。記錄疑似陰溝腸桿菌的粉色菌落數，并計算菌落的比例。

1.2.3 菌種PCR 鑒定 參考文獻〔6-7〕，合成陰溝腸桿菌特異性引物，正向引物：5′-CATGACACCGGT GTTTCCCCAGT-3′；反向引物：5′-CGGTCGGTGAAG CCCAGAACCACTA-3′。選取疑似陰溝腸桿菌進行菌落PCR 鑒定，PCR 擴增反應的體積為20 μL。用2% 瓊脂糖凝膠進行電泳分離，凝膠成像系統觀察并拍照〔8〕。

1.2.4 數據統計與分析 采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計分析，計數資料用（±s）表示。用Spearman秩相關進行結果的相關性分析，檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糞便涂片革蘭氏染色結果 將42 份糞便標本進行涂片染色，顯微鏡下觀察。每份均按照革蘭氏陽性（G+）桿菌、革蘭氏陽性（G+）球菌、革蘭氏陰性（G-）桿菌、革蘭氏陰性（G-）球菌分類依次計數，并計算所占比例。4 種菌落所占的比例分別為：（30.0±11.7）% ，（20.0 ±13.3）% ，（32.3 ±15.1）% ，（17.6 ±8.7）%。涂片結果顯示陰溝腸桿菌所屬的G-桿菌比例最高。

2.2 陰溝腸桿菌培養結果 將糞便標本以10-3、10-4g/mL 兩個稀釋濃度均勻涂布在伊紅美藍培養基上，分類和計數全部菌落。統計粉色菌落的疑似陰溝腸桿菌菌落數及所占比例。結果顯示，陰溝腸桿菌所占比例為（25.7±23.5）%。其中，男性（35.3±24.3）%，女性（16.1±18.7）%，男性陰溝腸桿菌比例大于女性（P=0.007）。

2.3 陰溝腸桿菌菌落PCR 鑒定結果 參考文獻〔7〕，特異性引物擴增的385 bp 大小的特異性條帶為陰溝腸桿菌部分基因序列。菌落PCR 鑒定結果中，1號和21 號泳道為陰溝腸桿菌的標準菌株，385 bp附近可見清晰條帶。見圖1。擴增序列中有13 份PCR 陽性的菌株在標準條帶300～400 bp 之間，與標準菌株的條帶位置一致。由此確證，伊紅美藍培養基中的粉紅色菌落為陰溝腸桿菌。

圖1 陰溝腸桿菌菌落PCR 鑒定結果圖

2.4 大學生BMI 分布 目前國際上常用的衡量人體胖瘦程度的標準為BMI〔9〕。BMI＜18.5 kg/m2為體質量過低；18.5 kg/m2≤BMI＜24.0 kg/m2為體質量正常；24.0 kg/m2≤BMI＜28.0 kg/m2為體質量超重；BMI≥28.0 kg/m2為肥胖。統計42 名大學生的BMI，其平均值為（22.2±3.8）kg/m2，具體分布情況見表1。

表1 大學生BMI 分布表（n=42）

2.5 不同BMI 組的陰溝腸桿菌菌落比例比較 進一步統計分析不同BMI 組陰溝腸桿菌的菌落比例。見圖2。其中，過低組陰溝腸桿菌菌落比例為（6.3±4.2）%，正常組為（20.9±18.3）%，超重組為（34.0±24.5）%，肥胖組為（64.0±32.2）%。由圖2 可見，4 個組中BMI 值越高，陰溝腸桿菌菌落比例也越高。但經卡方檢驗Fisher′s 確切概率法得P=0.277＞0.05，即各組間陰溝腸桿菌菌落比例的差異無統計學意義，推測此結果與樣本量偏低有關。

圖2 不同BMI 組陰溝腸桿菌比例分布圖

2.6 BMI 與陰溝腸桿菌菌落比例的相關性分析陰溝腸桿菌菌落比例與體質量之間呈正相關。見圖3。將兩者進行相關性分析，得到Spearman 秩相關系數rs= 0.529 ＞0.5（P＜0.001）。由結果可知BMI 與陰溝腸桿菌菌落比例之間呈正相關，且相關具有顯著性，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 陰溝腸桿菌菌落比例與BMI 的相關性

3 討論

肥胖是以脂肪代謝失衡為表現特征的一種營養性代謝紊亂疾病，已嚴重影響人類健康。腸道菌群可促進與脂肪合成相關的基因表達，并使肝臟脂肪細胞積累甘油三酯。此外，人體腸道內存在相對復雜的微生物群體，微生物群體不同，代謝效率也不同。不同的微生物組成會促進脂肪的能量儲存，或阻礙脂肪的消耗，從而導致肥胖。腸道內復雜的微生物菌群與人體的機體環境，以及外界環境的相互作用，會影響機體的營養、免疫和代謝〔10〕。腸道內壁上的保護屏障可抑制致病病原菌的入侵以及生長，它是由腸道菌群附著形成的，從而發揮對機體的保護功能〔11〕。

進入21 世紀，隨著我國經濟的快速發展，全國大學生的肥胖問題，已成為影響中國大學生身心健康的最重要因素之一〔12〕。2013年，美國醫學會就肥胖是一種疾病進行了正式的宣告〔13〕，世界衛生組織稱，截至2016年，全球肥胖人口超過6.5 億，預計到2030年全球肥胖患者將達到11.2 億〔14〕，肥胖患者人數在中國也在不斷增加。研究表明，肥胖對學生的血糖、心肺系統和心理健康有不同程度的影響，肥胖在未來的發展中會繼續影響兒童的健康〔15〕。如何預防肥胖流行已成為21 世紀上半葉全球面臨的最重大的公共衛生挑戰。

近年來，對影響人類肥胖的大量研究表明，環境因素具有重要的作用，其中尤為重要的是人類腸道系統中的共生微生物〔16-17〕。劉洋〔18〕發現人體的腸道菌群與體脂沉積、肥胖的發生發展有密切關系；趙立平在臨床研究中發現一位肥胖患者腸道陰溝腸桿菌過度增長，而在該患者體質量恢復正常后，陰溝腸桿菌數量降至檢測不到的水平〔4〕。這是首個關于腸道細菌引起肥胖癥的最直接的證據。

本研究發現，體質量過低組、正常組、過高組和肥胖組的糞便標本中，陰溝腸桿菌的菌落比例依次增加。此外，相關性分析發現，大學生陰溝腸桿菌菌落比例與其BMI 呈現顯著正相關。這在另一個側面，佐證了陰溝腸桿菌可能是影響肥胖的重要因素之一。然而，腸道陰溝腸桿菌如何影響BMI 等一系列問題，還需要進一步的研究。