對陰溝腸桿菌有強抑制活性乳酸菌的分離及鑒定

李亞飛，羅春雨，劉 奇

（大理大學基礎醫學院，云南大理 671000）

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是一種條件致病菌，能在人和動物的糞便、泥土或植物中檢出，屬于腸道正常菌種之一。自研究證明陰溝腸桿菌是造成肥胖的直接原因之一后〔1〕，掀起了一股對陰溝腸桿菌的研究熱潮。陰溝腸桿菌能夠引起人食源性疾病，現已被列為食品加工行業衛生檢測指標之一，經常能從水、食品加工廠、大米、家禽產品和水產品中分離得到。若在食物加工過程中消毒不徹底，則有可能造成陰溝腸桿菌的污染，其產生的大量腐胺等有害物質會導致食物的腐敗。也有研究〔2〕表明，以陰溝腸桿菌為病原菌且常累及多個器官的細菌性感染疾病發病率逐年上升。由于其產生的酶具有很強的耐藥性，因此臨床治療有難度。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB） 是目前應用最廣泛的益生菌之一，被認為是對抗腸道病原體感染極有前途的一種替代品。對乳酸菌的研究發現，其代謝產物可防止許多機會性病原體的過度生長，常見的有金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、大腸埃希菌等。另外，乳酸菌通過發酵碳水化合物產生的大量乳酸對陰溝腸桿菌生物膜形成有抑制作用〔3〕。鑒于陰溝腸桿菌數量增多是造成肥胖的直接原因之一〔1〕，本實驗以陰溝腸桿菌標準菌株ATCC 700323 為目標菌株，篩選大理地區泡菜樣本中分離出的對陰溝腸桿菌具有高抑制活性的乳酸菌，為研發具有潛在抑制肥胖功能的泡菜提供基礎，豐富傳統乳酸發酵食品潛在的減肥功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 在云南省大理市收集居民家中自制的泡菜樣品共17 份，乳酸菌發酵乳1 份，樣本合計18 份。

1.1.2 主要試劑 陰溝腸桿菌標準株ATCC 700323，由大理大學病原生物學綜合實驗室提供；pGM－Simple－T Fast Cloning Kit（北京天根生化科技有限公司）；PCR Amplification Kit（寶生物工程（大連）有限公司）；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（杭州愛思進生物技術有限公司）。

1.1.3 主要儀器 Applied Biosystems PCR 熱循環儀（美國Applied Biosystems 公司）；蛋白凝膠成像系統（美國Bio－Rad 公司）。

1.1.4 培養基制備 取BBL 瓊脂培養基基礎（青島博海生物科技有限公司）28 g，加400 μL 吐溫-80，用去離子水定容至400 mL，混合均勻。115 ℃高壓滅菌20 min，冷至50 ℃后平板分裝。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培養分離 將收集到的18 份樣本分別在BBL 平板上分區劃線接種，37 ℃厭氧培養24 h。

1.2.2 分離菌種的革蘭氏染色 對經BBL 培養基分離培養得到的疑似為乳酸菌的單個菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察記錄形態。

1.2.3 菌落PCR 鑒定 對分離培養得到的疑似菌落轉種過夜再培養，挑取新培養的單個菌落，對革蘭氏染色為陽性的全部細菌基因組DNA 用乳酸菌特異性引物進行菌落PCR 檢測，參照文獻〔4-5〕進行。正向引物：5′-GTAGCGGTGAAATGCGTAGATA TATGGAA-3′，反向引物：5′-GTGATCCAGCCGCAG GTTCTCC-3′。總擴增體系20 μL，相關循環參數如下：94 °C 預變性5 min；95 °C 變性40 s，57 °C 退火30 s，72 °C 延伸100 s，循環30 次；72 °C 延伸10 min。PCR 擴增產物取10 μL，進行瓊脂糖凝膠（0.7%，W/V）電泳鑒定，目的條帶大小為800 bp 左右。

1.2.4 分離菌株對陰溝腸桿菌抑菌活性的分析參考文獻〔6-7〕，分析分離得到的乳酸菌對陰溝腸桿菌（ATCC 700323）的抑菌作用。用比濁法將陰溝腸桿菌稀釋（0.5 個麥氏單位），均勻涂布于BBL 培養基上。然后將菌落PCR 擴增出的800 bp 條帶的菌株點種于已涂布好陰溝腸桿菌的平板上，37 ℃厭氧培養24 h，觀察所接乳酸菌周圍產生的抑菌圈大小，記錄結果，每個分離株重復3 次。

1.2.5 活性菌種目的條帶的切膠回收 將抑菌圈最大的菌株所對應的800 bp 條帶再次進行PCR擴增，并用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒切膠回收備用。

1.2.6 質粒構建TA 克隆 參照說明書，切膠回收800 bp 電泳條帶后，采用pGM-Simple-T Fast TA 克隆試劑盒構建TA 克隆〔8〕。無菌PCR 反應管中體系為：2 × RapiLigation Mix 5 μL，pGM -Simple -T Fast Vector（50 ng/μL）1 μL，1 μL 目的PCR 片段，重蒸水補足至10 μL。將轉化后的菌懸液用平板涂布法接種于含有20 μL 異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactosside，IPTG，10 mmol/L）和10 μL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal） 的氨芐青霉素抗性平板上，經藍白菌落篩選，37 ℃厭氧培養15～20 h，挑取白色菌落進行菌落PCR 重復鑒定。

1.2.7 測序鑒定 利用美國國家生物信息中心（NCBI）網站的Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具，對克隆片段測序比對，根據測序結果判斷PCR 分離的陽性菌株是否為乳酸菌。

2 結果

2.1 革蘭氏染色 18 份標本在BBL 培養基上生長出的單個菌落經革蘭氏染色后鏡檢，有17 份為紫藍色桿狀細菌，即為革蘭氏陽性桿菌，作為候選菌種進行后續鑒定。

2.2 乳酸菌的PCR 鑒定 革蘭氏染色鑒定為紫藍色桿菌的菌落，經PCR 鑒定，菌株1～2、4～18 擴增出了800 bp 片段，與目的條帶一致。見圖1。

圖1 不同菌株的PCR 電泳圖

2.3 分離菌株對陰溝腸桿菌的抑菌活性 不同樣本中分離得到的乳酸菌對陰溝腸桿菌的抑制作用不同，產生的抑菌圈大小不同。見表1。其中8 號菌株產生的抑菌圈最大，直徑為（2.10±0.15）cm；其次是16 號菌株，抑菌圈直徑為（2.00±0.16）cm。結果表明8 號菌株對陰溝腸桿菌ATCC 700323 抑制活性最強，所以選擇8 號菌株作為目的菌株。

表1 不同菌株對陰溝腸桿菌的抑菌圈直徑（±s）

表1 不同菌株對陰溝腸桿菌的抑菌圈直徑（±s）

菌株號 抑菌圈直徑/cm 菌株號 抑菌圈直徑/cm 11.60±0.15111.40±0.2021.00±0.18121.40±0.2341.60±0.14131.40±0.1551.40±0.17141.80±0.1461.60±0.12151.60±0.1871.80±0.10162.00±0.1682.10±0.15171.80±0.1591.80±0.17180.40±0.16101.60±0.18

2.4 800 bp 條帶的切膠回收及擴增 由于8 號菌株具有最強的抑制活性，后續實驗對8 號菌株進行TA 克隆構建及測序鑒定。首先切取8 號菌株800 bp 擴增條帶，經切膠回收后，再次進行重復大體系的擴增。見圖2。

圖2 800 bp 條帶的大體系擴增PCR 電泳圖

2.5 TA 克隆的構建及菌落PCR 驗證 將T 載體與8 號菌株大體系擴增切膠回收后的800 bp DNA 連接，經轉化、藍白斑篩選后，隨機挑取平板上8 個白色菌落，對其再次進行菌落PCR 技術鑒定，結果見圖3。其中8 號菌株的8－1、8－5 為陽性菌落。挑取菌落8－1、8－5 進行搖菌擴增后，取1 mL 菌液送昆明擎科生物科技有限公司測序。

圖3 TA 克隆的菌落PCR 鑒定結果圖

2.6 測序結果及比對 測序峰圖顯示，兩端引物結合的區域之間，峰圖無背景圖信號，測序結果質量高，見圖4。序列內容為：“GTAGCGGTGAAATGCG TAGATATATGGAAGAACCCCAGTGGCGAAGGCGG CTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAG TATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGA GGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATT AAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCT GAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAA GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAA ATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATG GATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG CAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGG CACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTA TGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTA CAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATC TCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGC AACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAAT CGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAA TTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTA GGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAG GGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACC TGCGGCTGGATCAC”。測序文件中，59～87 bp，889～910 bp 之間分別是F、R 引物的結合位點。其序列大小為852 bp，與電泳條帶大小吻合。將上述測得的序列結果用Blast 進行比對，比對結果見表2。明確了8 號菌為乳桿菌科（Lactoba cillaceae）的植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）或乳酸菌屬（Lactobacillus sp.），可以用作乳制品發酵及泡菜制作的菌種。

圖4 測序峰圖

表2 測序比對結果

3 討論

肥胖一直都是高血脂、糖尿病、動脈粥樣硬化等多種疾病的常見影響因素，嚴重危害人類健康。如何控制肥胖，研究其機制，一直都是科學家們關注的熱點。有研究〔9〕表明，陰溝腸桿菌是影響肥胖的關鍵因素，通過建立小鼠肥胖模型后發現，腸道內陰溝腸桿菌產生的內毒素脂多糖是導致宿主代謝紊亂和引起炎性反應的重要原因之一。本團隊之前也通過調查統計證明了大學生糞便中陰溝腸桿菌菌落數量與其BMI之間呈正相關，且具有統計學意義。

乳酸菌能產生乳酸，可調節機體胃腸道正常菌群，維持機體微生態穩定、抑制毒素，從而控制腸道內腐敗菌大量繁殖及腐敗相關產物的產生，對腸道進行保護〔10〕。有研究證明對于陰溝腸桿菌誘導的高脂肪飲食喂養的動物肥胖模型，植物乳桿菌具有很好的抗肥胖作用〔11〕。乳酸菌的物種多樣性和它在自然界分布廣、易獲取的特點，使其不論在學術研究還是生產生活中都具有重要的價值，廣泛應用于微生物分類研究、食品加工業、醫學研究等重要領域。因而有許多科研人員聚焦于優良乳酸菌的分離篩選及相關基因工程的改造研究〔12-13〕。現已有許多乳酸菌的鑒定方法，包括形態學鑒定、生化鑒定、基于基因水平上的鑒定等〔14〕，目前最主要的鑒定方法是基于基因水平的方法。Cocolin 等〔15〕首次通過PCRTGGE 技術擴增細菌16Sr DNA 序列V3 可變區的233bp 片段，成功鑒定出了6 種乳酸菌。潘渠等〔5〕進一步研究對比分析了已完成測序的14 種乳酸菌的16Sr DNA，設計出了一對乳酸菌特異性引物，且有較高的特異性。

云南省大理地區有著多年的食用泡菜傳統，泡菜制作最關鍵的因素就是乳酸菌，它是目前最主要的發酵菌劑。乳酸菌的發酵性能及安全性對人們健康至關重要。我們在大理地區收集了泡菜樣本和發酵乳制品18 份，旨在分離培養出對陰溝腸桿菌具有抑制優勢的乳酸菌種。研究結果顯示，收集到的泡菜樣本中分離的乳酸菌對陰溝腸桿菌具有不同的抑制活性，通過革蘭氏染色、菌落PCR 鑒定、抑菌活性分析，選取了抑制活性最強的菌株，再通過條帶切膠回收、大量擴增、TA 克隆構建、測序比對等一系列步驟最終鑒定該菌株為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）。后續實驗將進一步對肥胖人群中的不同陰溝腸桿菌分離株進行相關抑制活性測定。通過對該菌株的后續研究，有望使其成為泡菜產業化生產的純種菌株。