SPATA 48 基因的多態性與男性少精癥的相關性研究

孫文文，李鳳仙，尹以瑞，阿周存*

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2.大理大學農學與生物科學學院，云南大理 671003）

生精障礙是男性不育的主要病因之一，臨床上主要表現為無精癥和少精癥。研究表明，生精障礙的發病與遺傳因素密切相關〔1－2〕。目前為止，雖然發現了一些生精障礙的遺傳因素，但仍有大量與生精障礙相關的基因有待進一步研究。精子發生是一個眾多基因參與的復雜過程，其中任何一個基因的異常均有可能導致生精障礙〔3〕。因此，生精發生相關基因的研究，對生精障礙遺傳病因學有重要意義。生精相關（spermatogenesis－associated，SPATA）基因家族由一組在睪丸中表達的基因組成。在動物中的研究顯示，SPATA 基因家族在生精過程的多種細胞活動中發揮重要作用，如減數分裂、細胞凋亡、精子的生成和生殖細胞的發育等〔4－6〕。因此，SPATA 基因也被認為是人類生精障礙的重要候選基因。近些年來，一些SPATA 家族成員已被證實與人類的生精障礙有關〔7-8〕，但多數家族成員與生精障礙的關系還有待進一步研究闡明。

SPATA 48 基因是最近鑒定出的SPATA 基因家族的一個重要成員，它與人類生精障礙的關系還不完全清楚。本研究對SPATA 48 基因中的2 個常見單核苷酸多態（single nucleotide polymorphism，SNP）位點rs12672941 和rs998928 的多態性與少精癥的相關性進行調查，初步了解SPATA 48 基因與少精癥的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 病例組包括來自四川大學華西醫院和大理大學第一附屬醫院的279 例少精癥患者（精子密度小于15×106個/mL），對照組包括234 個精子密度正常的男性。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 DNA 提取試劑盒（TIANGEN 公司，批號：DP304）；dNTPs （TaKaRa 公司，批號：AJ30388A）；PCR 引物（上海生工生物工程股份有限公司）；Taq DNA 聚合酶（Fermentas 公司，批號：EP0404）；ExoI 酶（Fermentas 公司，批號：EN0581）；FastAP 酶（Fermentas 公司，批號：EF0654）；Snapshot試劑盒（ABI 分司，批號：4323163）；3730XL 基因測序儀（ABI 公司，美國）；PCR 擴增儀（Eppendorf 公司，型號：AG22331）；凝膠電泳儀（Bio－RAD 公司，型號：041BR）；凝膠成像分析系統（Bio－RAD 公司，型號：GelDoc100）。

1.3 方法

1.3.1 PCR 擴增 用DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）從200 μL 外周血中提取基因組DNA。rs12672941 和rs998928 的PCR 擴增引物序列、擴增片段長度見表1。PCR 擴增反應的體積為15 μL，反應條件為：94 ℃預變性5 min，35 個循環（94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s），72 ℃延伸3 min。

1.3.2 PCR 純化 用ExoI 酶和FastAP 酶進行純化。 反應體系為：PCR 產物3 μL，ExoI 酶4 U，FastAP 酶1 U，ExoI 緩沖液0.7 μL，用水補至7 μL。反應條件為：37 ℃保溫15 min，然后80 ℃保溫15 min。

1.3.3 Snapshot 基因分型 利用Snapshot 試劑盒（SNaPshotTMMultiplexKit） 進行延伸反應。Snapshot延伸反應的引物序列見表1。反應體系為：純化后的PCR 產物2 μL，Snapshot Mix 試劑1 μL，每條引物2 μmoL，用水補至6 μL。反應條件：96 ℃變性1 min，30 個循環（96 ℃變性10 s；52 ℃退火5 s），60 ℃延伸30 s。延伸反應結束后，取1 μL 延伸產物進行測序分型。對不同基因型的部分標本進行PCR產物直接測序，驗證Snapshot 基因分型結果。

表1 PCR 擴增的引物序列和擴增產物大小，Snapshot 延伸引物序列

1.3.4 統計學分析 用Hardy－Weinberg 平衡在線計算器進行Hardy－Weinberg 平衡檢驗。用χ2檢驗比較病例組和對照組之間等位基因和基因型頻率之間的差異，檢驗水準設為0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

SPATA48 基因SNP 位點rs12672941 和rs998928的等位基因和基因型分布見表2。如表2 所示，rs998928 的等位基因頻率和基因型頻率分布在病例組和對照組之間無顯著性差異（P ＞0.05）；rs12672941 等位基因頻率和基因型頻率分布在病例組和對照組間的差異具有統計學意義，等位基因C （28.5% vs. 22.8%，P = 0.040，OR=1.344，95%CI 為1.013～1.785）和含有C 等位基因的（TC/CC）基因型頻率（49.8% vs. 40.6%，P = 0.037，OR = 1.453，95%CI 為1.023～2.063）顯著高于對照組，而病例組TT 基因型頻率（50.1% vs.59.4%，P = 0.037，OR =0.688，95%CI為0.485～0.978）顯著低于對照組。

表2 rs12672941 和rs998928 的等位基因頻率和基因型頻率在對照組和病例組的分布

Hardy－Weinberg 平衡檢驗結果顯示，SPATA 48基因SNP 位點rs12672941 和rs998928 基因型分布在病例組和對照組中符合Hardy－Weinberg 平衡，提示本研究的研究對象具有群體代表性。Snapshot 基因分型技術結果見圖1，直接測序結果見圖2～3。Snapshot 基因分型技術結果和直接測序結果一致，表明本研究Snapshot 基因分型技術的結果準確、可靠。

續表2

圖1 Snapshot 基因分型技術結果

圖2 SPATA 48 基因SNP rs12672941 位點的基因測序結果

圖3 SPATA 48 基因SNP rs998928 位點的基因測序結果

3 討論

SPATA 48 基因是近些年來發現的一個人類生精障礙的重要候選基因，在基因敲出小鼠模型中的研究表明，SPATA 48 基因在精子發生過程中發揮重要作用，其異常與小鼠的生精障礙有關〔9〕。由于人和小鼠遺傳背景的差異，SPATA 48 基因是否也與人類的生精障礙有關，還需要進一步的研究闡明。本研究在正常男性和少精癥患者中，對SPATA 48基因的常見SNP 位點rs12672941 和rs998928 的等位基因頻率和基因型頻率進行調查和比較，從基因變異的角度來探索SPATA 48 基因與少精癥的關系。研究的結果顯示，SNP 位點rs12672941 的多態性分布正常男性和少精癥患者之間存在顯著差異，少精癥患者中的等位基因C 和基因型TC+CC 的頻率顯著高于正常男性，而基因型TT 的頻率則顯著低于正常男性，提示等位基因C 和基因型TC+CC增加少精癥的發病易感性，基因型TT 則降低少精癥的易感性。上述結果表明，SPATA 48 基因的SNP rs12672941 多態性影響少精癥的發病易感性。

SNP rs12672941 是一個內含子SNP，其T＞C 變異并不影響SPATA 48 蛋白的氨基酸組成，但該變異鄰近前體mRNA（precursor mRNA，pre－mRNA）的剪接點，提示它可能影響pre－mRNA 的剪接。因此，用ESEfinder 軟件〔10〕對其影響作用進行了分析。ESEfinder 分析結果顯示，SNP rs12672941 的T＞C變異會導致一些pre－mRNA 剪接蛋白結合基序的改變，影響pre－mRNA 剪接，最終可能影響SPATA 48基因的表達。由于SPATA 48 基因在生精過程中發揮重要作用，其表達的改變可能影響正常的生精過程，引起生精異常。這可能是SNP rs12672941 影響少精癥發病易感性的原因之一。

本研究首次對SPATA 48 基因的多態性與少精癥的相關性進行調查，結果顯示SPATA 48 基因的SNP rs12672941 的多態性影響少精癥的發病易感性。這一結果提示，SPATA 48 基因也可能與人類少精癥的發病相關。考慮到本研究樣本量偏少，且研究種族的單一性，故本研究的結果還需在更大樣本量和不同種族的研究中進一步證實。