基于多重熒光SSR 標記鑒別榧樹品種（品系）

黃徐駿，李海波，陳友吾，葉碧歡，宋其巖，胡傳久，沈建軍，廖榮俊

（1.遂昌縣妙高林業工作中心站，浙江 遂昌 323300；2.浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023；3.衢州市林業科技推廣站，浙江 衢州 324002）

榧樹Torreya gr andis隸屬于紅豆杉科Taxaceae 榧樹屬Torreya，雌雄異株，為第三紀孑遺植物，分布于長江流域以南地區，包括江蘇、浙江、福建、安徽、江西、湖北、湖南、云南、四川和貴州等省[1-3]。香榧T.grandis‘Merrillii’是榧樹中的優良變異株經人工選育后嫁接繁殖栽培的珍貴經濟樹種，具有食用、藥用、材用、綠化等多種用途[4-5]。香榧在實生嫁接繁殖中產生了豐富的變異類型，歷經多年的優株選育和大批量繁殖試驗，浙江省林業育種工作者選育出了多個榧樹優良品種。2011 年，良種‘細榧’T.grandis‘Xifei’通過國家林業局林木品種審定委員會審定。近年來，浙江省審（認）定了‘珍珠榧’‘大長榧’‘象牙榧’‘東白珠’‘脆仁榧’‘朱巖榧’‘丁山榧’‘東榧1 號’‘東榧2 號’‘東榧3 號’‘大葉種細榧’‘磐安長榧’‘玉山魚榧’‘磐大榧’‘磐安長榧’‘玉山魚榧’等眾多新品種[6-9]。此外，在野生榧樹資源中，一些植株的種實性狀變異顯著，如磐東榧、窈川大榧、大圓榧的種實為特大型，中圓榧的種實較大，大丁香的種實形狀為卵圓形，磐米榧的種實形狀為倒卵形。這些已被用作榧樹新品種選育材料，但目前尚未認定的品系在種實性狀以及成熟期、種核榧眼數等方面均與‘細榧’有明顯差別[10]。隨著榧樹新品種的不斷選育和香榧產業的發展壯大，這些新品種和品系的鑒定與知識產權保護也急需相應的分子技術手段跟進。

榧樹品種的鑒別一直是基于傳統的形態學上的分類，即根據盛果期榧樹果實或種子的性狀分為圓籽型（大、中、小圓榧等）和長籽型（細榧、芝麻榧、米榧、茄榧、獠牙榧、旋紋榧等）。這一鑒別方法需要在一年中的果實成熟后才能鑒定選種，無法進行早期鑒別。自2 000 年以來，一些基于PCR 的分子標記技術如RAPD、ISSR和SRAP 技術相繼用于香榧的品種分類、遺傳變異和居群遺傳多樣分析[3,7,11-15]。然而，這些分子標記所采用的均為通用型引物，其PCR 擴增圖譜不僅復雜、重復性差，且特異性不高，需經過大量的篩選工作，因此并不適合于品種鑒別。

SSR（簡單重復序列，或稱微衛星序列）具有多態性豐富、操作簡單、結果可靠、重復性好等優點，在DNA指紋圖譜的構建、遺傳多樣性分析、基因定位、分子標記輔助育種等方面得到廣泛的應用[16]。熒光SSR 標記的開發是基于DNA 測序平臺的毛細管電泳檢測方法，克服了傳統銀染法聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的不足，具有快速、高效、精確、靈敏等技術優勢。熒光SSR 標記技術成功用于了油茶Camellia o leifera、柑橘Citrussp.、高粱Sorghum bicolor、月季Rosesp.、楊樹Populussp.等種和品種鑒別[17-21]。近年來，有基于榧樹轉錄組測序開發SSR 標記的研究報道[22-23]，但尚未進行多態性篩選，或開發的SSR 標記進行了多態性篩選[24]，但并未用于榧樹品種（品系）鑒別。

多重PCR（Multiplex PCR）技術是在一個PCR 體系中包含多對引物組合，在一定的濃度配比和反應條件下，可以實現出多個核酸片段同時擴增的反應[25]。利用多重熒光SSR 標記技術可以同時檢測出多種基因型，從而解決了在進行大批量、多批次檢測時的費時、費力以及成本高的不足。迄今為止，熒光多重SSR 標記技術僅有用于楊梅Myrica rubra果實鑒定和玉蜀黍（玉米）Zea mays自交系檢測的報道[26-27]。因此，探索利用多重熒光SSR標記技術開發榧樹新品種或優良、特色品種的特征SSR 指紋（基因型），揭示品種間的基因型差異，對于優良品種的高效鑒別與新品種的知識產權保護具有重要意義。但迄今為止，國內外尚無利用多重熒光SSR 標記技術鑒別榧樹品種或品系的報道。本研究以9 個榧樹品種（品系）作為實驗材料，旨在探究利用多重熒光SSR 標記技術高效鑒別榧樹品種或品系的可行性，以期為該鑒別技術推廣應用到榧樹產業界、為榧樹新品種DUS（特異性、一致性和穩定性）測試和知識產權保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

用于本研究的9 個榧樹品種（品系）材料于2020 年11 月均采自浙江省磐安縣。9 個榧樹的品種（品系）名、倍性、形態特征及產地情況見表1。其中，‘玉山魚榧’‘細榧’‘磐安長榧’‘大香榧’‘獠牙榧’和‘磐大榧’為已通過審定良種，大丁香、大圓榧、中圓榧為尚未認定的品系，其名為暫定名。在本實驗中，對每個榧樹品種（品系）均采集3 株，取每株2 片幼嫩葉片，混合后放置于密封袋，硅膠干燥保存，至完全干燥后提取基因組DNA。

表1 9 個榧樹品種（品系）的基本信息Table 1 Nine Cultivars (Strains) of T.grandis for testing

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑包括植物基因組DNA 提取試劑盒（BioTeke，北京）、2×T5 Super PCR Mix（PAGE）（TSINGKE，北京）等。在SSR 正向引物上加注的熒光染料是FAM（藍）和HEX（綠），SSR 引物由北京擎科新業生物技術有限公司（TSINGKE，北京）合成。用于毛細管電泳檢測的內標試劑是Hi-DiTM Formamide (Applied Biosystems)、GeneScanTM-500 LIZ Size Standard（Applied Biosystems）。

主要儀器包括PCR 儀（Life ECO，Bioer，杭州）、DNA 分析儀（96-well plate,ABI 3730 XL Genetic Analyzer,Applied Biosystems,USA）、NanoDrop 2000（Thermo Scientific,USA）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA 提取 將每個榧樹品種（品系）的6 片經硅膠干燥后的幼嫩葉片混合粉碎，用混合樣提取基因組DNA。DNA 提取方法參照植物基因組DNA 提取試劑盒的操作說明，提取后的DNA 測定濃度，并經瓊脂糖凝膠電泳檢測，于－20℃保存備用。

1.3.2 SSR -PCR 分析 SSR 標記來源于前期對‘細榧’的轉錄組測序數據篩選。

為篩選多態性SSR 標記的20 L SSR-PCR 擴增體系為：2×T5 Super PCR Mix（PAGE）10 μL，FAM 熒光標記的SSR 正向和反向引物（10 mol·L-1）各1.5 μL，DNA 模板（20 ng·μL-1）3 μL，加ddH2O 補齊到20 μL；PCR反應條件為：98℃/2 min、98℃/10 s、退火10 s、72℃/10 s，反應持續30 個循環；最后72℃/2 min，4℃下終止反應。不同SSR 標記的退火溫度從50℃至60℃進行篩選優化。PCR 擴增產物先用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，對于可用的SSR 標記再進行毛細管電泳檢測，分析其在9 個榧樹品種（品系）間的多態性。

為建立Tg_U7 和Tg_U734 標記的多重PCR 擴增體系，對4 條SSR 引物的體積配比進行優化，最后確定了25 μL 多重SSR-PCR 擴增體系為：2×T5 Super PCR Mix（PAGE）12.5 μL，FAM 熒光標記的正向引物Tg_U7F和反向引物Tg_U7R（10 mol·L-1）分別為0.45 μL 和0.5 μL，HEX 熒光標記的正向引物Tg_U734F 和反向引物Tg_U734R（10 mol·L-1）分別為0.5 μL 和0.55 μL，DNA 模板（30 ng·μL-1）3 μL，加ddH2O 補齊到25 μL。PCR反應條件為：98℃/2 min、98℃/10 s、57.8℃/15 s、72℃/15 s，反應持續35 個循環；最后72℃/2 min，4℃下終止反應。

1.3.3 毛細管電泳檢測 內標配制方法采用項目組之前對普通油茶SSR 標記鑒別報道的方法[17,28]和多花黃精Polygonatum c yrtonema轉錄組SSR 標記開發報道的方法[29]。具體實驗步驟為：取10 m l H i-Di 和80 μL GeneScanTM-500 LIZ Size Standard 混勻，離心，以每孔10 μL 分裝于96 孔內標板，離心。將SSR-PCR 產物電泳，根據電泳膠圖做一定稀釋（最低可檢測標準為0.1 ng·μL-1），離心。取稀釋產物0.5 μL 加入到分配好的內標板中，混勻，離心，放入PCR 儀，于96℃變性5 min。20℃下迅速冷凍2 min，離心。置入DNA 分析儀進行毛細管電泳檢測。用Data Collection 3.0 軟件收集數據。

1.3.4 數據分析 用GeneMapper 4.1 軟件對Data Collection 3.0 軟件收集的原始數據進行分析。軟件系統將根據目標峰的位置與同一泳道中的內標GeneScanTM-500 LIZ S ize Standard 進行比較，直接給出目標SSR 片段的準確數值（bp）。純合位點的等位變異數據記錄為X/X，其中X 為該等位變異的數值大小；雜合位點的等位變異數據記錄為X/Y，其中X、Y 為該位點2 個不同等位變異的數值大小。

2 結果與分析

2.1 多態性SSR 標記的篩選

基于對細榧品種轉錄組測序得到的Unigenes 序列識別SSR 位點。從2 536 條Unigenes 中共找到2 742 個符合條件的SSR 位點。對含3～5 個核苷酸重復類型的SSR 位點的Unigenes 序列設計SSR 引物，以篩選可用于香榧材料鑒別的多態性SSR 標記。對40 對SSR 熒光引物合成后進行PCR 擴增，結果顯示其中的15 對沒有擴增出任何產物。進一步對25 對SSR 熒光引物的重復擴增顯示，其中的16 對引物可穩定擴增出清晰明亮的單一SSR條帶。對這16 個SSR 標記的毛細管電泳檢測表明Tg_U7 和Tg_U734 是具有穩定多態性的SSR 標記（表2）。

表2 用于榧樹品種（品系）鑒別的SSR 標記Table 2 SSR markers used for identification of cultivars of T. grandis

對9 個榧樹品種（品系）的Tg_U7 和Tg_U734 標記的基因型進行檢測，檢測結果見表3。由表3 可知，在9 個榧樹品種（品系）中，Tg_U7 可檢測出289/295、277/295 和277/289/295 三種基因型，Tg_U734 可檢測出192/222、192/216 和192/216/222 三種基因型。單一用Tg_U7 標記，只能鑒別出‘玉山魚榧’和大丁香，其基因型分別為289/295 和277/289/295；單一用Tg_U734 標記，只能鑒別出大丁香和‘磐大榧’，其基因型分別為192/216/222 和192/216，這表明盡管使用了多態性SSR 標記，但其對一定范圍內榧樹材料的鑒別能力不高，且需要進行二次PCR 反應。

2.2 基于多重熒光SSR 標記鑒別榧樹材料

為提高SSR 熒光標記對榧樹品種（品系）的鑒別效率，建立了Tg_U7 和Tg_U734 標記的多重SSR-PCR 擴增體系，通過對反應體系和退火溫度的優化，確定了在25 μL 的多重PCR反應體系中，Tg_U7F/Tg_U7R（10 mol·L-1）的體積配比為0.45 μL/0.5 μL，Tg_U734F/Tg_U734R（10 mol·L-1）的體積配比為0.5 μL/0.55 μL；最適退火溫度為57.8℃。擴增結果顯示，9 個榧樹品種（品系）在SSR 位點Tg_U7和Tg_U734 標記分別可擴增出4 種不同的基因型組合，根據特定的基因型組合可一次性鑒別3 個榧樹品種（品系），即‘玉山魚榧’‘磐大榧’和大丁香，其他6 個品種（品系）具有共同的基因型組合，不能鑒別到單一的品種（品系）（圖1、表3）。這表明基于多重熒光SSR 標記技術的基因型組合差異可作為榧樹品種或品系特異性的SSR 指紋，為榧樹材料的鑒別提供了高效便捷的分子技術手段。

圖1 Tg_U7 和Tg_U734 引物組合擴增的9 個榧樹品種（品系）的基因型Figure 1 Genotypes of 9 cultivars of T.grandis amplified with combinations of Tg_U7 and Tg_U734 primers

表3 9 個榧樹品種（品系）的基因型Table 3 Genotypes of 9 cultivars (Strains) of T.grandis

3 討論

本研究的基本技術思路是多態性SSR 標記的獲得和利用SSR 標記高效鑒別榧樹品種（品系）。要獲得多態性SSR 標記，需要對前期轉錄組測序數據的SSR 標記進行大量的篩選工作，要高效鑒別榧樹品種（品系），需要建立多重熒光SSR-PCR 反應體系。利用上述技術，本研究實現了對3 個榧樹品種（品系）‘玉山魚榧’‘磐大榧’和大丁香的高效鑒別。這一鑒別技術的重要價值在于可以應用到更多的榧樹品種（品系）鑒別，以及新品種（品系）的選育工作上。但在實際應用中，大樣本量的榧樹品種（品系）僅憑有限數量的多態性SSR 標記可能難以鑒別。因此，大量多態性SSR 標記的獲得是這一鑒別技術的核心。為此，在后續工作中，擴大浙江省榧樹品種（品系）的收集數量，在更大的轉錄組或基因組數據范圍內篩選出在榧樹品種（品系）間具有高度多態性的SSR 核心標記（SSR 核心引物），是這一鑒別技術推廣應用到榧樹產業界的前提條件，也可為榧樹新品種DUS（特異性、一致性和穩定性）測試和知識產權保護等方面提供技術支持。

在品種鑒別工作中，最理想的結果是獲得某個品種不同于其它品種的唯一性的DNA 指紋。事實上，僅僅一個多態性的SSR 標記往往達不到唯一性這個要求，尤其是品種數量擴大或出現新品種時。利用多態性SSR 標記的組合可有效提高鑒別能力，正如本研究利用Tg_U7 和Tg_U734 組合標記可一次性檢測出3 種不同的基因型組合，從而鑒別3 個榧樹品種（品系）。通過不同SSR 引物的組合提高引物的鑒別能力在棗Ziziphus j ujuba品種[30]、陸地棉（棉花）Gossypium hirsutum主栽品種[31]和多花黑麥草Lolium multiflorum品種[32]的鑒別中都成功應用。因此，通過多個多態性SSR 標記的組合有效提高鑒別能力，可保證本技術在實際應用中鑒別大樣本量的榧樹品種（品系）材料。

針對多個多態性SSR 標記的應用，本技術引入了多重熒光PCR 技術。多重熒光PCR 技術體系的建立旨在一個PCR 反應體系中一次性完成鑒別，不僅提高了工作效率，也減少了各種試劑和模板DNA 的用量。在多重熒光PCR 反應體系中的引物可以用不同顏色的基團（FAM、HEX、NED、PET 等）進行修飾，只要擴增片段的大小不重疊，在同一毛細管電泳的泳道中可檢測多達20 對以上的擴增片段，從而大幅度提高檢測效率[27]。因此，在獲得多個SSR 核心標記的基礎上，可進一步優化建立多個核心標記組合的多重熒光PCR 反應體系，避免了多個標記需要進行多次PCR 實驗，從而實現榧樹品種（品系）的高效鑒別。

此外，為獲得多個SSR 核心標記，后續對轉錄組SSR 標記的篩選工作量較大，勢必會增加熒光SSR 引物的合成成本，為此可嘗試利用TP-M13（Tailed Primer-M13）自動熒光檢測法，即將M13 序列作為通用的接頭，引入SSR 的熒光測序鑒定中，從而可以大幅度降低SSR 引物的篩選成本[33-34]。

4 結論

基于轉錄組測序數據篩選出了多態性SSR 標記Tg_U7 和Tg_U734，利用多重熒光PCR 技術將SSR 標記Tg_U7 和Tg_U734 整合，9 個榧樹品種（品系）在2 個SSR 位點Tg_U7 和Tg_U734 標記可擴增出4 種不同的基因型組合，分別為289/295 和192/222、277/295 和192/222、277/289/295 和192/216/222 以及277/295 和192/216，可一次性將3 個榧樹品種（品系）‘玉山魚榧’‘磐大榧’和大丁香鑒別出來。本研究表明基于多重熒光SSR標記技術的基因型組合差異可作為品種（品系）特異性的SSR 指紋，為榧樹品種（品系）的鑒別提供了高效便捷的分子技術手段。