動態pH值調控策略提高ε-聚賴氨酸發酵產量及其原因解析

鄧玥,柳天一,陳旭升*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一種由25～35個L-賴氨酸單體,在ε-PL合成酶催化下通過ε-氨基和α-羧基脫水縮合連接而成的同型氨基酸聚合物[1],具有廣譜的抑菌活性和優良應用屬性,現已被多個國家批準作為生物防腐劑在食品、化妝品防腐等領域應用[2-4]。近年來,在醫藥、生物制藥和農業等行業中也顯示出應用潛力[5-7]。因此,ε-PL具有廣闊的市場應用前景。

微生物發酵法是目前工業生產ε-PL的唯一方式,提升發酵水平以降低其生產成本是實現ε-PL廣泛應用的重要前提。因此,研究者們試圖通過菌株選育和發酵過程優化來提高生產菌的ε-PL發酵產量。相比于菌株選育,發酵過程優化與調控是一種簡單、快速提高產物發酵水平的有效手段。在ε-PL發酵優化和調控研究方面,KAHAR等[8]建立了兩階段pH值控制策略,結合葡萄糖和硫酸銨流加工藝,實現StreptomycesalbulusS410的ε-PL產量達到48.3 g/L,長期處于國際領先水平。ZHANG等[9]采用絲瓜囊作為細胞固定化載體,建立了攪拌式發酵罐Kitasatosporasp.MY 5-36重復批次發酵工藝,ε-PL平均產量達到34.11 g/L,固定化細胞重復利用5次,發酵周期達到526 h。LIU等[10]利用弱酸性陽離子樹脂D152進行ε-PL原位產物分離發酵的嘗試,在5 L發酵罐中進行192 h補料分批發酵,ε-PL質量濃度達到23.4 g/L,較游離菌體發酵ε-PL產量提高了6.2倍。作者所在實驗室提出了一種pH沖擊發酵策略,經過192 h補料分批發酵,可實現S.albulusM-Z18發酵甘油和葡萄糖生產ε-PL的產量分別達到54.7和47.13 g/L[11-12],幫助我國ε-PL發酵產量邁入國際先進行列。由此可見,通過優化菌體發酵方式和調控pH值能夠有效提升ε-PL發酵水平。

前期,本實驗室通過長期的菌株選育,獲得了1株ε-PL高產突變株S.albulusGS114,其搖瓶ε-PL產量較出發菌株S.albulusM-Z18提高了70%左右。然而,采用已有的培養條件和發酵控制策略,S.albulusGS114的ε-PL產量較出發菌株僅能提高13%左右[13]。如何建立針對性的發酵調控策略是發揮高產菌株生產潛能的關鍵。因此,本文通過調節pH值的方式來調控發酵中后期溶氧水平,以期提高S.albulusGS114的ε-PL發酵產量,并從氧化損傷角度,初步解析該策略提高ε-PL發酵產量的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

StreptomycesalbulusGS114,實驗室選育和保藏。

1.1.2 培養基

固體培養基(BTN)(g/L)：葡萄糖10,酵母粉1,魚粉蛋白胨2,pH 7.5。

種子培養基(g/L)：葡萄糖30,酵母粉8,(NH4)2SO45,KH2PO41.36,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4·7H2O 0.04,FeSO4·7H2O 0.03,pH 7.5。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖90,酵母粉8,(NH4)2SO45,KH2PO41.36,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4·7H2O 0.04,FeSO4·7H2O 0.03,pH 6.8。

1.1.3 試劑和儀器

葡萄糖,優級純,山東西王藥業有限公司；酵母粉,Oxide公司；其他試劑分析純,國藥化學試劑有限公司；過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測試劑盒,蘇州科銘生物技術有限公司。

5 L發酵罐,上海保興生物設備有限公司；T&J-Miniskid 1 L*4迷你平行生物反應器,迪比爾生物工程(上海)有限公司；UV-2100分光光度計,優尼科儀器有限公司；AB204-N分析天平,瑞士梅特勒公司；恒溫培養箱GNP-9160,上海光都儀器設備有限公司；3K15高速冷凍離心機,德國西格瑪公司；Enspire多標記檢測系統(酶標儀),珀金埃爾默有限公司；biotek多功能酶標儀,美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

種子培養：挑取2～3環孢子接種至種子培養基,30 ℃、200 r/min培養24 h。

不同pH條件的分批發酵：將培養好的種子液以體積分數8%接種量接入,裝液量為600 mL,溫度設置為30 ℃,初始轉速為200 r/min,溶氧設置為30%,轉速溶氧聯動控制。待pH分別自然下降至3.5、4.0、4.5和5.0時,用體積分數12.5%的NH3·H2O分別維持pH恒定直至發酵結束。

1.2.2 分析方法

活性氧(reactive oxygen species,ROS)測定：采用熒光探針2,7-二氯熒光雙乙酸鹽(2,7-dichlorofluorescent diacetate,DCFH-DA)測定,方法為：取80 μL發酵液置于1.5 mL離心管中,加入920 mL磷酸緩沖液進行稀釋懸浮后,再加入濃度為10 mmol/L的DCFH-DA 1 μL,充分混勻后置于30 ℃,200 r/min搖床中,反應40 min。12 000 r/min離心5 min,棄上清液,收集菌體,加入磷酸緩沖液12 000 r/min離心5 min洗滌4次,棄上清液,再加800 μL磷酸緩沖液重懸菌體,吸取200 μL于酶標孔中,在502、530 nm下檢測熒光強度,并通過蛋白濃度將其定量。根據熒光強度的大小即可反映胞內ROS的水平。

氧化損傷指標測定：丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量參考ZENG等[17]的方法。

羰基含量測定參考段麗菊等[18]的方法。

抗氧化體系測定：SOD、CAT和T-AOC按照試劑盒說明進行操作。

2 結果與討論

2.1 基于動態pH值調控溶氧水平策略發酵生產ε-PL的過程參數分析

低pH值沖擊工藝是本實驗室在優化S.albulusM-Z18發酵生產ε-PL時,建立的一種高效發酵生產ε-PL的控制策略。將該調控策略用于S.albulusGS114發酵生產ε-PL時(圖1-a),可實現ε-PL產量達到44.1 g/L,菌體量為38.99 g/L。相比于S.albulusM-Z18發酵結果,ε-PL產量提高了16%,但菌體量卻下降了24.4%,顯示出S.albulusGS114具有較高的單位菌體ε-PL合成能力。S.albulusGS114是經過基因組重排和核糖體工程連續選育,獲得的1株高產ε-PL突變株,其搖瓶ε-PL產量達到3.0 g/L,較出發菌S.albulusM-Z18提高了1.7倍。然而,S.albulusGS114作為二代菌株,在5 L發酵罐中ε-PL發酵產量僅較一代菌株S.albulusM-Z18提高了10%左右,顯示出S.albulusGS114仍有產量提升空間。如圖1-a所示,利用低pH沖擊工藝,可以實現S.albulusGS114產量達到44.1 g/L,菌體量為(38.99±3.83)g/L。另外,從發酵過程溶氧變化趨勢來看,從36 h開始溶氧水平逐漸上升,到96 h時溶氧水平達到70%并一直維持至發酵結束,意味著在發酵過程中S.albulusGS114出現了明顯菌體活力下降。因此,我們試圖通過提升菌體活力達到增加菌體量的目的,以進一步提高ε-PL產量。

為此,本研究通過發酵中后期動態調節pH值來控制發酵過程溶氧水平保持在20%～40%,從而建立了一種基于動態pH值調節溶氧水平的發酵控制策略,發酵過程參數如圖1-b所示。采用動態pH值調節溶氧水平的發酵控制策略,在48 h時適當提高pH值,隨后溶氧在60 h左右開始下降；當溶氧水平低于20%時,再適當下調pH值,如此反復,實現發酵過程溶氧水平維持在20%～40%。經過192 h補料分批發酵,DCW達到62.03 g/L,ε-PL產量達到(60.2±0.94)g/L,分別比未調控提高了59%和36%。由此可見,基于動態pH值調節溶氧水平的發酵控制策略,不僅能夠顯著改善S.albulusGS114生長狀況,而且能夠明顯提高其ε-PL發酵產量,實現二代菌株S.albulusGS114發酵產量的進一步提高,對提升工業發酵ε-PL水平具有重要指導意義。

a-pH沖擊策略；b-pH調控策略圖1 不同策略發酵過程中各指標變化Fig.1 Indices under different strategies during fermentation

2.2 動態pH值調控溶氧水平發酵生產ε-PL過程的氧化損傷相關參數分析

2.2.1 ROS水平及氧化損傷分析

a-ROS；b-MDA；c-羰基含量圖2 發酵過程中的氧化損傷參數比較Fig.2 Comparison of oxidation damage parameters during fermentation

分別以脂質氧化產物MDA(圖2-b)和蛋白質氧化產物羰基(圖2-c)的含量作為氧化損傷指標來評估ROS對菌體帶來的氧化損傷。如圖2-b所示,MDA含量隨著發酵進行而逐漸上升,在整個發酵過程中pH調控組始終略高于pH沖擊組,這也符合高ROS水平會給菌體帶來更高氧化損傷的一般認知。然而,如圖2-c所示,2組的羰基含量幾乎處于同一水平,直到發酵結束時才出現差異。這可能因為小白鏈霉菌的呼吸鏈位于細胞膜上,呼吸作用產生的ROS首先對膜脂質進行攻擊,同時膜脂質的氧化增加了電子泄露的可能[21],導致更高的ROS水平。

以上結果說明,隨著發酵的進行S.albulusGS114受到的氧化損傷程度逐漸增加,但是更高的ROS水平并未帶來更高的氧化損傷。這可能是因為通過pH調控策略使得菌體的活力增強,即使在ROS水平較高的情況下也能夠通過激活抗氧化系統來保護自身免受氧化脅迫的危害。

2.2.2 抗氧化能力分析

a-CAT；b-SOD；c-T-AOC圖3 發酵過程中抗氧化能力參數比較Fig.3 Comparison of antioxidant capacity parameters during fermentation

2.3 pH值對ε-PL發酵過程中氧化損傷相關參數影響的分析

為了探究動態pH值調控溶氧發酵過程中,ROS水平升高和菌體抗氧化能力提高的原因,本研究分別考察了S.albulusGS114在pH 3.5、4.0、4.5和5.0的ROS水平和菌體T-AOC。如圖4-a所示,pH值越高DCW越大,在pH 5.0發酵條件下,菌體生長情況最好；而在pH 3.5時,DCW在36 h達到最大之后開始逐漸下降,表明S.albulusGS114在此pH值下不適宜生長。圖4-b顯示的是不同pH值下菌體細胞內的ROS水平。pH值越高,ROS水平越高,除pH 3.5外,ROS在12～24 h激增,在24～48 h波動不大,48 h后迅速增加,整體上呈現先上升后穩定再上升的趨勢。這可能是由于在較高的pH下,菌體生長狀態較好,其呼吸活力較強,產生的ROS水平就越高,這個結果與pH調控組的ROS水平較高相吻合(圖3-a)。圖4-c顯示的是對不同pH下S.albulusGS114胞內的總抗氧化能力進行了比較。菌體總抗氧化能力與發酵pH值高地成正比,pH 3.5時抗氧化能力明顯低于其他3組,這也與其菌體生長情況相吻合,表明較低的pH不僅抑制了S.albulusGS114的正常生長,也抑制了其胞內各種代謝的正常進行。通過考察不同pH條件下S.albulusGS114的ROS水平和T-AOC發現,pH值越高ROS水平越高,在pH 4.0與4.5時,隨著發酵時間的增加,ROS水平的差異逐漸增大,由于pH調控策略在發酵過程中有較長的一段時間需要將pH提升至4.0以上,因此在pH調控的發酵過程中ROS一直處于較高的水平；菌體的總抗氧化能力也與發酵pH值成正比,這可能是由于pH越高,S.albulusGS114生長狀態越好,呼吸活力的增強帶來了更多的ROS,從而激活胞內的抗氧化系統,使得自身的總抗氧化能力得到增強。

a-DCW；b-ROS；c-T-AOC圖4 不同pH發酵的菌體量、ROS水平和抗氧化能力比較Fig.4 Comparison of biomass,ROS level and T-AOC during fermentation with different pH

3 結論

為了提高S.albulusGS114的ε-PL發酵產量,本文通過在發酵中后期動態調節pH值來控制發酵過程溶氧水平在20%～40%,建立了一種基于動態pH值調節溶氧水平的發酵控制策略,ε-PL產量達到(60.2±0.94)g/L,較未調控發酵提高了36%。通過氧化損傷相關參數分析,初步揭示了動態pH值調節溶氧水平提高ε-PL發酵產量的原因：動態調節pH值策略顯著增強了發酵中后期菌體生長能力和總抗氧化能力(包括過氧化氫酶活性),以維持菌體胞內ROS產生水平維持在菌體可以承受的范圍,促進了ε-PL在發酵中后期的生物合成。很多研究都已表明ROS具有調節次級代謝產物的作用[22-24],本研究結果初步發現了ROS對促進ε-PL生物合成的潛在作用,因此下一步將考察ROS是否直接調節聚賴氨酸的合成,為提升工業發酵ε-PL水平提出進一步指導。